Structure-function studies of tubulin-modifying enzymes

Abstract

Microtubules (MTs) exhibit high genetic diversity due to the existence of multiple α- and β- tubulin isoforms, encoded by distinct genes with tissue-specific expression patterns. MT functional properties are further diversified by post-translational modifications (PTMs), forming a complex regulatory system known as the tubulin code. The thesis aims to investigate the structure and function of tubulin tyrosine ligase-like 11 (TTLL11), an enzyme with marked polyglutamylase activity. TTLL11 modifies not only tubulin but also other physiological substrates, including Dishevelled 3 (DVL3) from the Wnt signaling pathway. To elucidate the substrate specificity and catalytic mechanism of the enzyme, we evaluated a series of TTLL11 variants for their capacity to bind and polyglutamylate tubulin in vitro and in a cellular environment. Our findings revealed that, while TTLL11 shares sequence similarity with other TTLL enzymes exclusively within its catalytic domain, its C-terminal region is indispensable for function. Using cryo-electron microscopy (cryo-EM), we uncovered a unique interaction pattern between TTLL11 and MTs, wherein the TTLL11 MT-binding helix bundle (MT-BHB) engages with one protofilament, while its catalytic domain extends over an adjacent protofilament. Importantly, we discovered a novel...

Mikrotubuly (MTs) vykazují vysokou genetickou rozmanitost díky mnoha izoformám α- a β- tubulinu, které jsou kódovány různými geny a vykazují tkáňově specifickou expresi. Jejich vlastnosti jsou dále diverzifikovány posttranslačními modifikacemi (PTMs) a vytváří komplexní regulační systém zvaný tubulinový kód ("tubulin code"). TTLL11, enzym s vysokou polyglutamylasovou aktivitou, modifikuje nejen tubulin, ale také další proteiny, včetně Dishevelled 3 (DVL3) ze Wnt signální dráhy. Pro objasnění substrátové specificity a katalytického mechanismu TTLL11 jsme navrhli a exprimovali řadu variant, otestovali jejich aktivitu a schopnost vázat se na mikrotubuly. Přestože TTLL11 sdílí sekvenční podobnost s jinými glutamylasami (TTLL) pouze v katalytické doméně, jeho C-koncová doména (MT-BHB) se ukázala nezbytná pro vazbu na mikrotubuly i enzymatickou aktivitu. Pomocí kryo-elektronové mikroskopie (cryo-EM) jsme odhalili konformační uspořádání, v němž se C-koncová doména (MT-BHB) TTLL11 váže na jeden protofilament, zatímco jeho katalytická doména přesahuje nad sousední protofilament. Dále jsme identifikovali novou posttranslační modifikaci tubulinu, při níž dochází k přímému prodloužení C-konce tubulinu, což umožňuje návrat variant αΔ2 a αΔ3, dříve považovaných za "konečné produkty", zpět do cyklu tubulinových...