Nové komplexy bakteriálního transkripčního systému

Abstract

5 Abstract This thesis focuses on the study of a novel RNA polymerase (RNAP) complex with a previously unidentified interaction partner in Bacillus subtilis. The presence of this complex was first observed during the purification of RNAP from a strain carrying a deletion of the gene encoding the transcription recycling factor. The aim of the work was to optimize the conditions for native purification of this complex, perform its biochemical and biophysical characterization, and obtain structural information using cryogenic electron microscopy (cryo-EM), chemical crosslinking, and small-angle X-ray scattering (SAXS). In the experimental part, various strategies of affinity and size-exclusion chromatography were employed and optimized for the native isolation of the complex from Bacillus subtilis cells. Structural analyses included SAXS measurements at the PETRA III synchrotron in Hamburg, 3D reconstructions of the electrostatic potential of particles measured by cryo-EM, and crosslinking analysis using mass spectrometry. The results confirm the binding of the new partner to RNAP under the conditions of the native purifications used. Structural techniques indicate interaction at the region of the primary channel of RNAP. The current structural findings are also compatible with the observed transcriptional...

4 Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá studiem nového komplexu RNA polymerasy (RNAP) s novým interakčním partnerem u bakterie Bacillus subtilis. Přítomnost tohoto komplexu byla poprvé zaznamenána při purifikaci RNAP z kmene s delecí genu pro transkripční recyklační faktor. Cílem práce bylo optimalizovat podmínky nativní purifikace tohoto komplexu, provést jeho biochemickou a biofyzikální charakterizaci a získat strukturní informace pomocí metody kryogenní elektronové mikroskopie (kryo-EM), chemického síťování a maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS). V experimentální části byly využity a optimalizovány různé strategie afinitní a gelové permeační chromatografie pro nativní izolaci komplexu z buněk Bacillus subtilis. Strukturní analýzy zahrnovaly měření SAXS na synchrotronu PETRA III v Hamburku, 3D rekonstrukce elektrostatického potenciálu částic měřených pomocí kryo-EM a analýzu chemického síťování hmotnostní spektrometrií. Výsledky potvrzují vazbu nového partnera na RNAP v podmínkách použitých nativních purifikací. Strukturní techniky ukazují na vazbu na RNAP v oblasti primárního kanálu. Současné výsledky strukturních analýz jsou kompatibilní i s pozorovanou inhibicí transkripce v přítomnosti tohoto partnera. Diskutovány jsou možné funkce tohoto komplexu v regulaci transkripce u Bacillus...