Design a analýza signalizační kapacity cytokinů pozměněných proteinovým inženýrstvím

Abstract

Cytokines are key mediators of cell-to-cell communication and attractive therapeutic targets. Their broader use is limited by the demanding and costly production of functional recombinant forms in eukaryotic systems; bacterial expression is cheaper but often fails due to misfolding and loss of activity. The aim of this work was to design stabilized variants of interleukins IL- 9, IL-26 and IL-31, to verify their producibility in a bacterial expression system, and to assess the preservation of biological function. The strategy was based on in silico design of stabilizing mutations using PROSS. Mutations in the binding interface were then identified by comparison with experimentally solved structures of homologous interleukin-receptor complexes. The effect of individual mutations on protein expression was assesed using a yeast surface display system with flow cytometry readout. Mutations that did not have a substantial effect on protein expression were excluded from the final construct. Final constructs were expressed in a bacterial expression system and subsequently purified by tandem nickel chelate affinity chromatography and size-exclusion (gel permeation) chromatography. The purification course and product purity were evaluated by SDS-PAGE. Biological activity was assessed in a model of human...

Cytokiny představují klíčové mediátory buněčné komunikace a zároveň atraktivní terapeutické cíle. Jejich širší využití však naráží na obtížnou a nákladnou produkci funkčních rekombinantních forem v eukaryotických systémech; bakteriální exprese je sice levnější, ale často selhává na nesprávném skládání a ztrátě aktivity. Cílem této práce bylo navrhnout stabilizované varianty interleukinů IL-9, IL-26 a IL-31, ověřit jejich produkovatelnost v bakteriálním expresním systému a posoudit zachování biologické funkce. Strategie vycházela z výpočetního návrhu stabilizačních mutací metodou PROSS. Následně byly identifikovány mutace variant zasahující vazebné místo srovnáním s experimentálně vyřešenými strukturami homologních komplexů interleukinu s receptorem. Vliv individuálních mutací na expresi proteinu byl ověřen pomocí kvasinkového zobrazovacího systému využitím průtokové cytometrie. Mutace, které neměly zásadní vliv na expresi proteinu, byly z finálního konstruktu vyřazeny. Finální konstrukty byly exprimovány v bakteriálním expresním systému a následně purifikovány pomocí tandemu niklové chelatační a gelové permeační chromatografie. Průběh purifikace a čistota byly vyhodnoceny pomocí SDS-PAGE. Biologická aktivita byla hodnocena na modelu lidských buněčných linií transfekovaných receptorovými...