Příprava rozpustných forem aktivačního receptoru myších NK buněk NKR-P1C

Abstract

Natural killer (NK) cells are a key component of innate immunity, capable of rapidly recognizing and eliminating virally infected or tumor-transformed cells without the need for prior antigenic stimulation. They possess on their surface an extensive repertoire of activating and inhibitory receptors, enabling them to distinguish healthy cells from pathological ones. NKR-P1 (natural killer receptor-protein 1) is the first discovered family of NK cell receptors of the C-type lectin-like group, comprising both activating and inhibitory forms. NKR-P1C is an activating receptor expressed on the surface of murine NK cells, capable of forming covalent homodimers and interacting with ligands such as the immunoevasins of murine cytomegalovirus. This thesis focuses on the preparation of recombinant forms of the extracellular domain of the NKR-P1C receptor in a mammalian expression system. HEK293T, HEK293S GnTI⁻, and Expi293F GnTI⁻ cell lines were used, into which constructs encoding the extracellular portion of NKR-P1C were introduced, either as a fusion construct with an IgG Fc fragment or as a shortened construct with a His-tag. The expressed proteins were purified using affinity and size-exclusion chromatography, followed by characterization with SDS-PAGE, analytical ultracentrifugation, mass spectrometry,...

NK buňky (z angl. natural killer cells) představují klíčovou složku vrozené imunity, schopnou rychle rozpoznat a eliminovat virově infikované či nádorově transformované buňky bez nutnosti předchozí antigenní stimulace. Na svém povrchu nesou rozsáhlý repertoár aktivačních a inhibičních receptorů, které jim umožňují rozlišit zdravé buňky od patologických. NKR-P1 (z angl. natural killer receptor-protein 1) je první objevená rodina NK buněčných receptorů podobných lektinům C-typu, zahrnující jak aktivační, tak inhibiční formy. NKR-P1C je aktivační receptor exprimovaný na povrchu myších NK buněk, schopný tvorby kovalentních homodimerů a interakce s ligandy, mezi něž patří např. imunoevasiny myšího cytomegaloviru. Tato práce se zaměřuje na přípravu rekombinantních forem extracelulární domény receptoru NKR-P1C v savčím expresním systému. Byly použity buněčné linie HEK293T, HEK293S GnTI⁻ a Expi293F GnTI⁻, do kterých byly zavedeny konstrukty kódující extracelulární část NKR-P1C, a to buď jako fúzní konstrukt s Fc-fragmentem IgG, nebo jako zkrácený konstrukt s His-kotvou. Exprimované proteiny byly purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a následně charakterizovány metodami SDS-PAGE, analytické ultracentrifugace, hmotnostní spektrometrie a analýzy termální stability pomocí nanoDSF....