Využití nekanonických aminokyselin pro studium proteinové struktury a interakcí/koordinace kovu a přenosu elektronů v modelovém metaloproteinu (azurin z organismu P. aeruginosa)

Abstract

This bachelor's thesis focuses on the employment of non-canonical amino acids (ncAAs) for studying the structure and function of metalloprotein, particularly using the bacterial azurin from Pseudomonas aeruginosa as a model. The aim was to express mutant forms of azurin (Az2W) in two systems-one with partial incorporation of the non-canonical amino acid azidohomoalanine (AHA) at methionine positions, and one without AHA incorporation (grown in LB medium)-and to subsequently purify both forms. Our goal was to evaluate the potential of this modification for structural characterization using chemical cross-linking with amine-reactive cross-linkers after reduction of the azide group. At the same time the effect of AHA incorporation into Met 121 position (Cu2+ axial ligand) on the UV-VIS behaviour of azurin was studied. The experimental part included protein expression in different growth media, with the higher expression yield of azurin in LB medium. The mineral M9 medium resulted in significantly lower azurin protein yield. Subsequntly, electrophoretically homogeneous samples were successfully obtained from both cell cultures with expressed protein. Unfortunately, during storage there was partial degradation of the protein with Met (LB medium) in the sequence and partial loss of Cuš , ⁺ most likely...

Tato bakalářská práce se zabývá využitím nekanonických aminokyselin (ncAA) pro studium struktury a funkce metaloproteinů, konkrétně u modelu azurinu z bakterie Pseudomonas aeruginosa. Cílem bylo exprimovat dvě mutantní formy azurinu (Az2W) s částečnou inkorporací ncAA. L-azidohomoalaninu (AHA) v pozici Met v sekvenci proteinu a nebo protein bez AHA inkorporace (LB medium), a následně obě formy purifikovat. Naším cílem bylo ověřit možnosti využití této modifikace pro strukturní charakterizaci pomocí chemického síťování s amino reaktivním síťovacím činidlem pro redukci azidoskupiny. Současně byl studován efekt inkorporace AHA do pozice Met 121 (axiální ligand Cu2+ ) na UV-VIS chování azurinu. Experimentální část zahrnovala expresi proteinů v různých růstových médiích, přičemž exprese v minerálním M9 médiu poskytla výrazně nižší produkci proteinu azurinu než v případě LB média. Následně se z obou buněčných kultur s exprimovaným proteinem podařilo získat elektroforeticky homogenní preparáty. Bohužel během uskladnění došlo k částečné degradaci proteinu s Met (LB) a částečné ztrátě Cu2+ nejspíše v důsledku mikrobiální kontaminace z použité destilované vody. V případě preparátu s inkorporací AHA došlo k jeho precipitaci a ztrátě. Přesto výsledky ukazují, že azurin Az2W si zachovává při částečné...