Příprava modelové aspartátové proteasy a vysokokapacitního systému pro testovaní jejich inhibitorů

Abstract

(EN) Aspartic proteases are implicated in a wide range of pathological processes and therefore represent attractive molecular targets for therapeutic intervention. High-throughput screening (HTS) provides a robust and efficient approach for identifying lead compounds to support the development of novel chemotherapeutic agents. This bachelor's thesis focuses on the development and optimization of an HTS assay specific to aspartic proteases. The model aspartic protease (cathepsin D from the hard tick, CatD) was produced as a recombinant protein in a bacterial expression system and purified to homogeneity using affinity and ion-exchange chromatography. The biochemical properties of CatD were characterized, including its pH optimum for enzymatic activity, protein thermal stability, kinetic parameters (KM, Vmax, kcat and kcat/KM) with peptide substrates, and inhibitory constants (IC50 and Ki) for selected inhibitors. An HTS assay for CatD was established and optimized in a 1536-well plate format. This CatD assay was validated and used to screen an FDA-approved drug library of small molecules to identify novel aspartic protease inhibitors as part of a drug repurposing strategy. This work introduces a functional HTS platform for evaluating small molecules as potential CatD inhibitors and demonstrates its...

(ČJ) Aspartátové proteasy se podílejí na celé řadě patologických procesů, a proto představují perspektivní molekulární cíle pro vývoj nových terapií. Vysokokapacitní systém pro testování molekul (VST, z angl. "High-Throughput Screening") poskytuje robustní a efektivní přístup k identifikaci sloučenin (tzv. "lead compounds"), které podporují vývoj nových chemoterapeutik. Tato bakalářská práce je zaměřena na zavedení a optimalizaci reakčních podmínek VST pro aspartátové proteasy. Modelová aspartátová proteasa (katepsin D z klíštěte obecného, KatD) byla připravena v bakteriálním expresním systému a purifikována pomocí afinitní a iontoměničové chromatografie na aktivní enzym o vysoké čistotě. KatD byl dále biochemicky charakterizován stanovením pH optima enzymové aktivity, teplotní stability proteinu, kinetických parametrů (KM, Vmax, kcat, kcat/KM) s peptidovými substráty a inhibičních konstant (IC50 a Ki) s vybranými inhibitory. Byla navržena a optimalizována reakční směs pro KatD v podmínkách VST využívající formát 1536-jamkových mikrotitračních destiček. Vyvinutý systém byl validován a použit k testování malých molekul z knihovny schválených léčiv ("FDA-approved drug library") s cílem identifikovat nové inhibitory aspartátových proteas (tzv. "drug repurposing). Bakalářská práce přináší funkční...