Sekvenční syntéza cukerných nukleotidů

Abstract

Sugar nucleotides serve as glycosyl donor for glycosyltransferases (EC 2.4) and are responsible for the catalysis of various sugar and non-sugar acceptors, affording oligosaccharides and diverse glycoconjugates. In vivo they are involved in cellular communication, immune response, and serve as structural molecules. The main challenge in utilizing glycosyltransferases is the high cost and limited availability of sugar nucleotides. The solution is to produce these compounds in the largest possible quantities from cost-effective starting materials. In this work, four enzymes for the production of three different sugar nucleotides were expressed in Escherichia coli (E. coli) and purified: UDP-N-acetylgalactosamine, UDP- N-acetylglucosamine a UDP-galactose. The activity and stability of all enzymes were determined. Then, the synthesis of these sugar nucleotides was performed using repetitive batch synthesis. The resulting products were isolated and characterized by NMR. Keywords E. coli; glycosidase; glycosyltransferase; human milk oligosaccharide; synthesis

Cukerné nukleotidy slouží jako donory glykosylu pro glykosyltransferasy (EC 2.4), a jsou tak zodpovědné za katalýzu glykosylace různých cukerných i necukerných akceptorů za vzniku oligosacharidů a rozmanitých glykokonjugátů. In vivo se účastní buněčné komunikace, imunitní odpovědi, či tvoří stavební molekuly. Hlavním úskalím využití glykosyltransferas je vysoká cena a malá dostupnost jejich donorů - cukerných nukleotidů. Řešením je tyto látky produkovat v co největším množství z cenově dostupných výchozích látek. V rámci této práce byli v Escherichia coli (E. coli) exprimovány a purifikovány čtyři enzymy pro produkci tří různých cukerných nukleotidů: UDP-N-acetylgalaktosaminu, UDP- N-acetylglukosaminu a UDP-galaktosy. U všech enzymů byla stanovena jejich aktivita a stabilita. Následně byla navržena a optimalizována syntéza těchto cukerných nukleotidů repetitivní vsádkovou syntézou. Připravené produkty byly izolovány a byli charakterizovány pomocí NMR. Klíčová slova E. coli; glykosidasa; glykosyltransferasa; oligosacharid mateřského mléka; syntéza