Engineering Linker-Defined Nucleosomal Arrays for Proteomic Profiling

Abstract

Eukaryotic genomes are packaged into chromatin, a dynamic nucleoprotein complex in which nucleosomal units are connected by stretches of linker DNA. Its length is variable, quantized and highly controlled. Spacing strongly influences higher-order chromatin folding, accessibility, DNA integrity and potentially the recruitment of chromatin- associated factors. However, the precise biological reasons why eukaryotes set specific spacing patterns remain largely unknown. To study the impact of internucleosomal spacing on protein interactions in a controlled biochemical setting, a library of DNA constructs was generated based on the Widom 601 nucleosome positioning sequence, with defined linker lengths and compatible cloning sites. The constructs were designed to allow easy multiplication of repeats, enabling the assembly of longer arrays. DNA fragments were biotinylated for immobilization and reconstituted with recombinant histone octamers to yield variably spaced nucleosomes. As a proof of principle, dinucleosomal arrays were immobilized on streptavidin-coated magnetic beads and incubated with nuclear extracts in a pulldown experiment. Captured proteins were analyzed, revealing preliminary insight on protein binding patterns and linker-dependent differences. These experiments establish the feasibility...

Eukaryotické genomy jsou uspořádány do chromatinu, dynamického nukleoproteinového komplexu, ve kterém jsou nukleozomové jednotky propojeny úseky spojovací (linker) DNA. Délka těchto úseků je variabilní, kvantovaná a přísně regulovaná. Vzdálenost mezi nukleozomy významně ovlivňuje vyšší úrovně skládání chromatinu, jeho přístupnost, integritu DNA a potenciálně i interakce faktorů asociovaných s chromatinem. Přesné biologické důvody, proč eukaryota nastavují konkrétní vzorce vzdáleností, však zůstávají nepřezkoumané. Pro studium vlivu internukleozomální vzdálenosti na interakce proteinů v kontrolovaném biochemickém prostředí byla vytvořena knihovna DNA konstruktů založená na polohovací sekvenci Widom 601 s definovanou délkou linker DNA a kompatibilními klonovacími místy. Konstrukty byly navrženy tak, aby umožňovaly snadnou propagaci opakujících se jednotek a sestavení delších nukleozomálních řetězců. DNA fragmenty byly značeny biotinem pro imobilizaci a následně rekonstituovány s rekombinantními histonovými oktamery za vzniku nukleozomů s různými délkami linker DNA. Jako ověření funkčnosti byly dinukleozomy imobilizovány na streptavidinových magnetických kuličkách a inkubovány s jadernými extrakty v afinitní purifikaci. Zachycené proteiny byly analyzovány a poskytly předběžný náhled na profily vazby...