Rychlá detekce a kvantifikace varianty m.3243A>G v genu MT-TL1 u českých pacientů se suspektním monogenním diabetem

Abstract

Mitochondrial diabetes is maternally transmitted. Patients with this disease have cells containing a mixture of mitochondria with and without the pathogenic mitochondrial DNA variant (heteroplasmy). The most commonly detected pathogenic variant is m.3243A>G in the MT-TL1 gene, which damages pancreatic ß-cell function. The clinical phenotype of patients carrying this variant is highly variable, even within a single family. The aim of the thesis was to introduce a fast and reliable molecular-genetic method enabling to early detect patients with mitochondrial diabetes. The method of quantitative real-time polymerase chain reaction with fluorescent probes was chosen, and plasmids carrying 100% reference and alternative gene variants were prepared. Using these and control samples with a known degree of heteroplasmy, the method was optimized and validated. The detection rate was set at 1 % heteroplasmy. A cohort of 232 individuals was compiled from the Czech national registry of patients with suspected monogenic diabetes with an unknown causative variant. The m.3243A>G variant was detected in 4/232 (1.7 %) individuals, with heteroplasmy levels ranging from 8.0 to 28.5 %. Most of them have been previously diagnosed with type 2 diabetes. Early and accurate determination of the presence and degree of heteroplasmy of...

Mitochondriální diabetes je onemocnění přenášené po mateřské linii. Buňky pacientů s tímto onemocněním obsahují mitochondrie s mixem mitochondriální DNA s patogenní variantou a bez ní (heteroplazmie). Nejčastěji detekovanou patogenní variantou je m.3243A>G v genu MT-TL1, která způsobuje poškození funkce ß buněk pankreatu. Klinický fenotyp pacientů nesoucích tuto variantu je velmi variabilní, a to i v rámci jedné rodiny. Cílem diplomové práce bylo zavedení rychlé a spolehlivé molekulárně-genetické metody umožňující včasné odhalení pacientů s mitochondriálním diabetem. Byla zvolena metoda kvantitativní real- time polymerázové řetězové reakce s fluorescenčními sondami. Byly připraveny plazmidy se 100% zastoupením referenční a alternativní varianty. Pomocí nich a kontrolních vzorků o známé míře heteroplazmie byla metoda optimalizována a validována. Míra detekce byla stanovena na 1 % heteroplazmie. Z českého národního registru pacientů se suspektním monogenním diabetem, u nichž nebyla objevena kauzální varianta, byla sestavena kohorta čítající 232 osob. Varianta m.3243A>G byla detekována u 4/232 (1,7 %) osob a míra heteroplazmie se u nich pohybovala od 8,0 do 28,5 %. Dosud byli zkoumaní pacienti většinou vedeni s diagnózou diabetu 2. typu. Včasné a přesné stanovení přítomnosti a stupně heteroplazmie varianty...