Study of mammalian NudiX enzymes and their RNA decapping activity

Abstract

(EN) The discovery of non-canonical RNA caps such as NAD, FAD, and dinucleoside polyphosphates (NpnNs) has expanded the known portfolio of RNA modifications. However, the physiological relevance and metabolic fate of these RNA caps remain poorly understood. NudiX hydrolases, known for cleaving nucleotide-derived substrates with polyphosphate backbones, are major candidates for hydrolyzing these non-canonical RNA caps. While some mammalian NudiX enzymes have been shown to act on some small molecules and capped RNAs, their broader substrate specificity remains largely unexplored. This thesis systematically investigates the substrate specificity of seven selected mammalian NudiX enzymes, with a particular focus on their RNA decapping activity. The study includes expression and purification of the mouse NUDT12 enzyme, as well as the synthesis and purification of capped 6-mer RNAs, tested as potential NudiX substrates. To assess enzymatic activity, a newly optimized malachite green assay (MGA) was employed. Among the tested enzymes, HsNUDT2 was identified as the only enzyme that preferentially hydrolyzes RNA substrates over small molecules. This work provides the first systematic comparison of RNA versus small molecule substrate specificity across multiple mammalian NudiX enzymes and validates MGA as a...

(CZ) Objev nekanonických RNA čepiček, jako jsou NAD, FAD a dinukleosid polyfosfáty (NpnNs), rozšířil portfolio známých RNA modifikací. Fyziologický význam a metabolický osud těchto RNA čepiček však zůstávají dosud nedostatečně prostudovány. NudiX hydrolasy, známé svou schopností štěpit substráty odvozené od nukleotidů s polyfosfátovou kostrou, představují hlavní kandidáty pro hydrolýzu těchto nekanonických RNA čepiček. Ačkoliv bylo prokázáno, že některé savčí NudiX enzymy působí na některé malé molekuly a čepičkované RNA, jejich širší substrátová specificita zůstává do značné míry neprozkoumána. Tato diplomová práce systematicky studuje substrátovou specificitu sedmi vybraných savčích NudiX enzymů, s hlavním zaměřením na jejich hydrolýzu RNA čepiček. Studie zahrnuje expresi a purifikaci jednoho z enzymů, myšího NUDT12, stejně jako syntézu a purifikaci čepičkovaných hexamerních RNA, které byly následně použity jako substráty NudiX enzymů. K vyhodnocení enzymové aktivity byl použit nově optimalizovaný test s malachitovou zelení (MGA). Mezi testovanými enzymy byl HsNUDT2 jediný, který preferenčně štěpil RNA substráty před malými molekulami. Tato práce poskytuje první systematické srovnání RNA a malých molekul jakožto substrátů pro savčí NudiX enzymy a potvrzuje, že MGA je spolehlivou a...