Amplifying the signal of a light-producing deoxyribozyme using EXPAR

Abstract

Deoxyribozymes are DNA based catalysts which have certain advantages over protein and RNA catalysts like a lower synthesis cost and lower sensitivity to their environment. Our group has evolved a luminescent deoxyribozyme Supernova which is able to transfer a phosphate from substrate to its 5'end. The substrate, containing 1,2-dioxetane (commercially known as CDP-Star), decomposes after dephosphorylation and releases light which can be detected by a plate reader. However, Supernova can phosphorylate itself just once and is unable to release the covalently attached phosphate. Upon splitting the sequence into two strands, the phosphorylated strand is able to dissociate from the other strand. In this way it is possible for one Supernova strand to phosphorylate multiple substrate strand for 20 hours. The goal of this project is to optimise the multiple turnover version of an enhanced version of Supernova and exponentially amplify the "enzyme" strand using EXPAR. This work presents optimisation results for the multiple turnover Supernova, as well as implementation of amplification using EXPAR method. Key words: Deoxyribozyme; Exponential Amplification of DNA; chemiluminescence; sensor; multiple turnover

Deoxyribozymy jsou katalyzátory na bázi deoxyribonukleové kyseliny. Oproti proteinovým a RNA enzymům mají řadu výhod, mezi které patří podstatně méně nákladná syntéza a nižší náročnost na manipulační podmínky či podmínky pro uchovávání. V naší laboratoři jsme vyvinuli deoxyribozym Supernova schopný přenášet fosfát ze substrátu na svůj 5'konec. Substrát, molekula obsahující 1,2-dioxetan (komerčně CDP-Star), se po odstranění fosfátu rozloží a vyzáří světlo, které lze přístrojově měřit. Supernova je však schopna reagovat pouze jednou. Pokud ale strukturu deoxyribozymu Supernova rozštěpíme na dvě části, tak část, na kterou se váže fosfát, může disociovat od té, která reakci katalyzuje. Takto rozštěpená verze je schopna opakovaně katalyzovat reakci po dobu dvaceti hodin. Cílem této práce je optimalizovat reakci rozštěpené Supernovy (resp. její vylepšené verze E-Supernova) a nalézt způsob, jak katalytickou část Supernovy exponenciálně amplifikovat za izotermálních podmínek pomocí metody EXPAR. Po přidání druhé části do reakční směsi bude deoxyribozym katalyzovat defosforylaci CDP-Star. V této práci prezentujeme výsledky optimalizace podmínek pro reakci rozštěpeného konstruktu a také implementaci amplifikace pomocí metody EXPAR. Klíčová slova: deoxyribozym; exponenciální amplifikace DNA;...