Characterization of protein structures beyond natural selection and protein design

Abstract

Proteins derived from random sequence space remain largely unexplored, yet they provide a new perspective on protein folding and evolution. This thesis investigates whether such proteins can adopt defined structural elements and resemble folds of natural proteins without evolutionary optimization. Out of the 21 sequences selected from a combinatorial library of random proteins, 17 were successfully expressed in Escherichia coli, and four were chosen for further characterization. During purification, the proteins exhibited concentration-dependent aggregation and a dynamic equilibrium between monomeric and multimeric forms, suggesting the presence of partially folded molten globule states. Only protein 4 could be purified in sufficient quantity for biophysical analysis. Due to aggregation, protein 4 was purified under denaturing conditions and refolded in the presence of Triton X-100. Circular dichroism spectroscopy revealed predominantly α-helical content with β-sheet elements, consistent with computational structure predictions. The multimeric nature of refolded protein 4, observed by size exclusion chromatography, prevented folding characterization by nuclear magnetic resonance. Nevertheless, the circular dichroism results support that random sequences can form defined secondary structures, and...

Proteiny pocházející z náhodného sekvenčního prostoru zůstávají z velké části neprozkoumané, nabízejí však nový pohled na skládání proteinů a jejich evoluci. Tato práce zkoumá, zda takové proteiny mohou vytvářet definované strukturální elementy a zda se podobají strukturám přirozených proteinů bez vlivu evoluční optimalizace. Ze 21 sekvencí vybraných z kombinatorické knihovny náhodných proteinů bylo 17 úspěšně exprimováno v Escherichia coli a čtyři byly vybrány k další charakterizaci. Během purifikace proteiny vykazovaly agregaci závislou na koncentraci a dynamickou rovnováhu mezi monomerními a multimerickými formami, což naznačuje přítomnost částečně složených stavů typu molten globule. Pouze protein 4 bylo možné purifikovat v dostatečném množství pro biofyzikální analýzu. Kvůli agregaci byl protein 4 purifikován za denaturačních podmínek a znovu složen za přítomnosti Tritonu X-100. Spektroskopie cirkulárního dichroismu ukázala převážně α-helikální strukturu s přítomností β-listů, což odpovídá strukturní predikci. Multimerní charakter proteinu 4, pozorovaný pomocí gelové chromatografie, znemožnil studium sbalení proteinu pomocí jaderné magnetické rezonance. Přesto výsledky z cirkulárního dichroismu potvrzují, že náhodné sekvence mohou vytvářet definované sekundární struktury, a shoda...