Vývoj biosensoru pro monitorování aktivity alkalické fosfatasy s využitím oxidativního graftingu borem dopované diamantové elektrody

Abstract

This thesis builds upon a previous study in which the surface of boron-doped diamond electrodes (BDD) was modified by oxidative grafting of p-aminobenzoic acid. Within this work, the influence of the redox marker [Ru(NH3)6]2+/3+ on the stability of the modified layer was tested, and the effect of pH on the dissociation of carboxyl groups on the modified electrode surface was thoroughly investigated. The experimental pKa value was determined and compared with the theoretical one. Furthermore, the activity of the enzyme alkaline phosphatase (ALP) was monitored on an unmodified BDD electrode using the substrate L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P), which is enzymatically converted to the electrochemically active L-ascorbic acid (AA). The effects of enzyme and substrate concentrations on the course of enzymatic dephosphorylation were studied by voltammetric detection of the generated product signal. In the final part, the modified electrode surface was activated using EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide) and NHS (N˗hydroxysuccinimide) chemistry, and ALP was covalently immobilized on the electrode surface to create a model enzymatic biosensor. The results confirm the potential of this electrochemical system for the future development of sensors based on the detection of enzymatic activity...

Tato diplomová práce navazuje na předchozí studii, ve které byl povrch borem dopované diamantové elektrody (BDD) modifikován pomocí oxidativního graftingu p˗aminobenzoové kyseliny (PABA). V rámci diplomové práce byl testován vliv redoxního markeru [Ru(NH3)6]2+/3+ na stabilitu modifikované vrstvy a podrobně zkoumán vliv pH na disociaci karboxylových skupin modifikovaného povrchu elektrody, přičemž byla stanovena experimentální hodnota pKa a porovnána s hodnotou teoretickou. Dále byla sledována aktivita enzymu alkalické fosfatasy (ALP) na nemodifikované BDD elektrodě za použití substrátu kyseliny 2-fosfo-L-askorbové (AA2P), která je enzymatickou reakcí přeměněna na elektrochemicky aktivní kyselinu L-askorbovou (AA). Byly zkoumány vlivy koncentrace enzymu a substrátu na průběh enzymatické defosforylace sledované voltametricky prostřednictvím odezvy vznikajícího produktu. V závěrečné části byla modifikovaná elektroda aktivována pomocí EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′- ethylkarbodiimid) a NHS (N-hydroxysukcinimid) chemie a enzym ALP byl kovalentně navázán na povrch elektrody za účelem vytvoření modelového enzymového biosenzoru. Výsledky potvrzují potenciál tohoto elektrochemického systému pro budoucí vývoj senzorů založených na detekci enzymatické aktivity a její inhibice.