Role, biogenesis and biodegradation of dinucleoside polyphosphate RNA caps in prokaryotes

Abstract

(Česky) Cílem této disertační práce je prozkoumat mechanismy, jimiž jsou dinukleosidové polyfosfáty (NpnNs), třída nekanonických iniciačních nukleotidů (NCIN), inkorporovány do bakteriální RNA. Již dlouho známé alarmony NpnNs, které se v buňkách akumulují při stresu, byly nedávno identifikovány jako 5′ RNA čepičky, což odhalilo novou úroveň regulace genové exprese u bakterií. V této práci jsem se snažila odpovědět na otázku, zda jsou NpnN čepičky instalovány na RNA post-transkripčně za pomocí enzymů, nebo ko-transkripčně RNA polymerázou. Zároveň zkoumám regulační faktory, které ovlivňují jejich inkorporaci do RNA. Jako první krok jsme potvrdili přítomnost Ap₄A-čepičkovaných RNA transkriptů u E. coli in vivo pomocí LC-MS. Následně jsme zkoumali mechanismus tvorby čepičkované RNA. Přestože Lysyl- tRNA syntetáza (LysRS) byla schopna produkovat volné Ap₄A za našich podmínek, nebyla schopná katalyzovat produkci Ap4A-RNA. Tento závěr podporuje hlavní teorii, že NpnN-RNA je produkovaná přímou inkorporaci NpnN jakožto NCIN pomocí RNA polymerázy a že inkorporace NpnN je regulována genetickým kontextem promotoru, případně dalšími transkripčními faktory. S využitím modelové Thermus thermophilus RNA polymerázy jsme zkoumali, jak sekvence promotéru ovlivňuje využití NpnN. Biochemické studie, následované cryo-EM...