Principles of nuclear organization

Abstract

Cajal bodies (CBs) are dynamic, membraneless nuclear compartments involve in the biogenesis and maturation of small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), with the protein coilin serving as their primary costituent. This thesis investigates the molecular mechanisms underlying CB assembly and maintenance, focusing on the roles of coilin oligomerization, RNA interactions, and coilin-snRNP binding. Through the generation and analysis of CRISPR/Cas9-mediated coilin knockout cell lines and a series of coilin mutants, including a previusly unknown mutation (K496E) present in a widly use coilin plasmid, this work reveals that both coilin self-interaction (mediated by the N-terminus) and its association with snRNPs (via the C-terminus) are indispensable for CB formation. Advance microscopy techniques show that CBs are structurally heterogeneous and possess a selective diffusion barrier, with coilin exchange between CBs and nucleoplasm being tightly regulated. Crucially, RNA is shown to be essential for coilin oligomerization and CB integrity: RNase microinjection leads to rapid CB disassembly, and RNA depletion impairs coilin self- association. Detailed mutational analyses demonstrate that conserved residues and loops in the Tudor domain are required for snRNP binding and CB formation, while coilin...

Cajalova tělíska (CBs) jsou dynamická, membránou neohraničená jaderná oddělení zapojená do biogeneze a zrání malých jaderných ribonukleoproteinů (snRNPs), přičemž protein coilin slouží jako jejich hlavní stavební složka. Tato práce zkoumá molekulární mechanismy podílející se na formování a udržování CB, se zaměřením na úlohy oligomerizace coilinu, interakcí s RNA a vazby coilinu na snRNPs. Prostřednictvím vytvoření a analýzy CRISPR/Cas9-mediovaných knockout buněčných linií coilinu a série mutantů coilinu, včetně dříve neznámé mutace (K496E) přítomné v široce používaném plasmidu s coilinem, tato práce odhaluje, že jak samovazba coilinu (zprostředkovaná N-koncem), tak jeho asociace se snRNPs (prostřednictvím C-konce) jsou nezbytné pro formování CB. Pokročilé mikroskopické techniky ukazují, že CB jsou strukturálně heterogenní a disponují selektivní difúzní bariérou, přičemž výměna coilinu mezi CB a nukleoplazmou je přísně regulována. Kriticky důležité je, že RNA se ukazuje jako nezbytná pro oligomerizaci coilinu a integritu CB: mikroinjekce RNázy vede k rychlé disintegraci CB a deplece RNA narušuje samovazbu coilinu. Detailní mutační analýzy demonstrují, že konzervované zbytky a smyčky v Tudorově doméně jsou vyžadovány pro vazbu na snRNPs a formování CB, zatímco samotná oligomerizace coilinu je...