Extracelulárni vezikuly v tekutinách reprodukčního traktu savců

Abstract

V současném době se v oblasti výzkumu klade důraz na extracelulární vezikuly (EVs) jakožto možné faktory ovlivňující reprodukční procesy, a to zejména pro jejich významnou roli v mezibuněčné komunikaci. Tyto heterogenní membránové nanostruktury, uvolňované téměř všemi typy buněk, zprostředkovávají mezibuněčnou signalizaci prostřednictvím přenosu bioaktivních molekul, proteinů, lipidů a různých forem RNA, a jsou proto považovány za klíčové modulační faktory v mnoha fyziologických i patologických procesech, včetně procesů spojených s reprodukcí, jako je maturace gamet, fertilizace a embryonální vývoj. Cílem této práce bylo izolovat a charakterizovat a funkčně analyzovat EVs z reprodukčních tekutin prasat, konkrétně z epididymální tekutiny (caput, corpus, cauda), semenné plazmy (SP) a oviduktální tekutiny, včetně EVs získaných ex vivo produkcí pomocí 3D kultivace ve FiberCell bioreaktoru. Izolace EVs byla uskutečněna ombinací centrifugace, filtrace a gelové chromatografie. Výsledné frakce obsahovaly vezikuly velikosti odpovídající exozomům a mikrovezikulám (40-400 nm), které byly následně charakterizovány pomocí elektronové mikroskopie (EM) a dynamického rozptylu světla (DLS). Metodou Western blot (WB) byly detekovány vezikulární markery jako jsou CD9, CD81, ALIX a posttranslační modifikace...

Currently, research is focusing on extracellular vesicles (EVs) as possible factors influencing reproductive processes, especially because of their important role in intercellular communication. These heterogeneous membrane nanostructures, released by almost all cell types, mediate intercellular signalling through the transfer of bioactive molecules, proteins, lipids and various forms of RNA, and are therefore considered as key modulating factors in many physiological and pathological processes, including those associated with reproduction, such as gamete maturation, fertilization and embryonic development. The aim of this work was to isolate, characterize, and functionally analyze EVs from porcine reproductive fluids, specifically from epididymal fluid (caput, corpus, cauda), seminal plasma (SP), and oviductal fluid, including EVs obtained by ex vivo production using 3D culture in a FiberCell bioreactor. Isolation of EVs was optimized by a combination of centrifugation, filtration and size-exclusion chromatography. The resulting fractions contained vesicle sizes corresponding to exosomes and microvesicles (40-400 nm), which were subsequently characterized by electron microscopy (EM) and dynamic light scattering (DLS). Vesicular markers such as CD9, CD81, ALIX, and post-translational modifications...