Identifikace nových zástupců hemových senzorových proteinů a jejich biochemická charakterizace

Abstract

Hemoproteins represent a large class of proteins containing hem within their active site, that are involved in numerous essential biological processes, such as gas transport, redox reactions, enzymatic catalysis and cellular signaling. One of the main groups of heme proteins are sensor proteins containing heme, whose function is to detect various signaling molecules, primarily gases such as oxygen, nitric oxide, or carbon monoxide, and even the heme molecule itself. Given their important role in the proper functioning of the organism, it is not surprising that scientific research is intensively focused on both clarifying their structural-functional mechanisms of signal transport and discovering new representatives of this diverse group of proteins. This bachelor's thesis, therefore, focused on studying the interaction of heme with the protein pyruvate kinase, which is speculated to be one of the new possible representatives of the group of heme-sensor proteins. For the analysis of interaction between heme and pyruvate kinase, was this protein expressed using a recombinant plasmid carrying the corresponding gene construct and subsequently purified from the E. coli cells. This approach allowed for the acquisition of sufficient amounts of purified protein for further analyses, that proved isoform of...

Hemoproteiny tvoří rozsáhlou skupinu proteinů, které se podílejí na celé řadě klíčových biologických procesů, včetně přenosu plynů, redoxních reakcí, enzymové katalýzy a buněčné signalizace. Mezi jednu z hlavních skupin hemoproteinů patří senzorové proteiny obsahující hem, jejichž funkcí je detekce různých signálních molekul, zejména plynů jako je kyslík, oxid dusnatý nebo oxid uhelnatý, případně i samotné molekuly hemu. Vzhledem k jejich široké roli ve správném fungování organismu není vůbec překvapivé, že se vědecký výzkum intenzivně zaměřuje jak na objasnění jejich strukturně-funkčních mechanismů přenosu signálu, tak i na objevování nových zástupců této rozmanité skupiny proteinů. Proto tato bakalářská práce byla zaměřena na zkoumání interakce hemu s klíčovým enzymem lidského metabolismu, a to konkrétně pyruvátkinázou, o němž se spekuluje, že by mohl patřit mezi nové zástupce skupiny hemových senzorových proteinů. Pro studium interakce hemu s pyruvátkinázou byl tento protein exprimován za použití rekombinantního plazmidu nesoucího příslušný genový konstrukt a následně izolován z buněk E. coli. Tento postup umožnil získat dostatečné množství purifikovaného proteinu pro další analýzy, které prokázaly, že izoforma enzymu pyruvátkináza M2 interaguje specificky s hemem. Klíčová slova: hem, senzorové...