Chemická modifikace glykopeptidů a predikce jejich retenčního chování při hydrofilní kapalinové chromatografii

Abstract

5 Abstract In this master's thesis, retention mechanism of glycopeptides during hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) was studied. For these purposes, propionylation and formylation of the peptide backbone was used to deliberately change its properties such as hydrophobicity, polarity and charge. Glycopeptide backbone was also modified through the simultaneous usage of two proteases (trypsin and AspN/GluC). Digestion of glycoproteins with two proteases led to a loss of different amino acids which made it possible to study the effect of said amino acids on the retention of analysed glycopeptides during HILIC separation. Sialylated and modified/doubly digested glycopeptides were analysed using HILIC-MS. Significant effect of glycopeptide charge on retention was identified using the difference of retention times between unmodified and modified/doubly digested glycopeptides during HILIC separation. Glycopeptide modifications involving change in charge led to relative retention difference of 1,17 ± 0,04 while glycopeptide modifications not involving change in charge led to less significant relative retention difference of 1,04 ± 0,03. The effect of position of peptide backbone modification was also studied: the retention of glycopeptides modified on N-terminus and C-terminus was identical,...

4 Abstrakt V rámci této diplomové práce bylo studováno retenční chování glykopeptidů při hydrofilní kapalinové chromatografii. Pro tyto účely bylo využito propionylace a formylace peptidové páteře glykopeptidů za cílem změny vlastností jako hydrofobicita, polarita a velikost náboje peptidové části glykopeptidu. Pro úpravu peptidové páteře glykopeptidů bylo také využito současné štěpení glykoproteinů dvěma proteázami (trypsin a AspN/GluC). Štěpení dvěma proteázami vedlo ke zkrácení peptidové páteře glykopeptidů o různé aminokyseliny, čímž bylo možné pozorovat jejich vliv na retenci glykopeptidů při HILIC. Odlišně sialované a modifikované/štěpené glykopeptidy byly analyzovány hydrofilní interakční kapalinovou chromatografií ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Pozorováním rozdílů v retenci nemodifikovaných a modifikovaných/štěpených glykopeptidů pěti glykoproteinů byl určen výrazný vliv náboje glykopeptidů na jejich retenční chování při HILIC. Bylo zjištěno, že zvyšování velikosti náboje glykopeptidu retenci zkracuje a snižování prodlužuje. Změny velikosti náboje vedly průměrně ke změnám relativní retence 1,17 ± 0,04. Rozdíl retence u glykopeptidů, jejichž náboj zůstal nezměněný, byl výrazně menší s průměrnou hodnotou změny relativní retence 1,04 ± 0,03. Dále bylo zjištěno, že modifikace na N-konci a...