Localization and dynamics study of Nkrp1 protein isoforms in mammalian cells

Abstract

Abstakt (CZ) Membránové proteiny, včetně receptorů, kanálů a transportních molekul, hrají klíčovou roli v buněčné signalizaci díky své lokalizaci na plazmatické membráně. Tyto proteiny často vytvářejí oligomerní struktury, jejichž složení a uspořádání ovlivňují jejich funkci. Určení stechiometrie a oligomerizačního stavu proteinů je proto nezbytné pro hlubší porozumění buněčných procesů. Zatímco stechiometrii proteinů lze studovat rozsáhlým výběrem analytických metod, studium oligomerizace membránových receptorů na povrchu živých buněk zůstává výzvou. V této práci je prezentována aplikace Försterova rezonančního přenosu energie (FRET) s použitím homotypických fluoroforů pro studium oligomerizace receptorů na povrchu živých buněk. Změny fluorescenční anisotropie v závislosti na stupni oligomerizace umožňují kvantitativní vyhodnocení a v kombinaci s dalšími biochemickými technikami je možné docílit charakterizace proteinů v nativním buněčném prostředí. Tato práce se zaměřuje na komplexní studium myších Nkrp1 receptorů s cílem objasnit jejich oligomerizační stav na povrchu živých buněk. Různorodost funkcí Nkrp1 receptorů nás vedla ke studiu a srovnání jejich struktur. Navzdory předpokladu, že Nkrp1 proteiny tvoří disulfidicky vázané homodimery, naše data naznačují, že oligomerizační stav těchto receptorů na...

Cell surface receptors play an important role in signal transduction initiated by diverse external stimuli, owing to their localization on the plasma membrane. Membrane proteins encompass molecules such as signaling receptors, channels, pumps, transporters, enzymes, and others. These molecules can form oligomeric structures with varying numbers of subunits on the cell surface. To fully understand the function of individual proteins, it is essential to determine their stoichiometry and to address whether they function as monomers, dimers, or larger oligomers. Stoichiometry of proteins can be studied using various methods, however, determining the oligomerization state of receptors on the surface of living cells remains challenging. Förster resonance energy transfer (FRET) using homotypic fluorophores allows for the quantification of fluorescence anisotropy, which is dependent on the degree of oligomerization. Combined with other biochemical approaches, this technique enables the characterization of proteins in their native environment. This Ph.D. thesis focuses on the study of mouse Nkrp1 receptors as a model system to determine the oligomerization state of proteins on the surface of living cells. As this is a family of receptors with both activating and inhibitory properties, it is intriguing to...