Enzymatic synthesis of hypermodified DNA bearing anionic or cationic functional groups

Abstract

SOUHRN Tato disertační práce popisuje syntézu dvou sad na bázi modifikovaných 2'-deoxyribonukleosid-5'-O-trifosfátů (dNR TP) nesoucích nabité funkční skupiny, jejich aplikaci v enzymatické syntéze k získání různých typů hypermodifikovaných DNA a následné biofyzikální studie získaných DNA forem. Dvě sady dNR TP, obsahující buď aniontové nebo kationtové modifikace, byly syntetizovány pomocí Sonogashirovy reakce. Aniontové (kyselé) skupiny zahrnovaly karboxylát, sulfonát, fosfonát a fosfát, zatímco kationtové (zásadité) modifikace tvořily amino, methylamino, dimethylamino a trimethylamonium skupiny. Získané dNR TP byly systematicky testovány jako substráty pro enzymatickou syntézu DNA pomocí dvou DNA polymeráz. Všechny aniontově i kationtově modifikované nukleotidy byly úspěšně začleněny do DNA metodou prodloužení primeru (PEX), a to jak jednotlivě, tak v různých kombinacích. Navíc bylo možné nahradit všechny čtyři kanonické nukleotidy v PEXu buď aniontovými, nebo kationtovými dNR TP, což vedlo k syntéze hypermodifikovaných DNA sond, kde každá nukleobáze nese odlišnou funkční skupinu. DNA nesoucí všechny čtyři aniontové modifikace byla pojmenována 'superaniontová DNA', díky dvojnásobnému zápornému náboji ve srovnání s přirozenou DNA. Naopak pro hypermodifikovanou DNA obsahující celou škálu kationtových skupin...