Optimalizace dekonjugačních reakcí u stanovení hladin endokrinních disruptorů v plasmě.

Abstract

Každý organismus je vystaven působení množství antropogenních látek z prostředí, kterou mohou mít nežádoucí endokrinní aktivitu. Takové látky nazýváme endokrinní disruptory (ED). V organismu jsou ED aktivní ve své volné formě, při průchodu játry jsou z velké části konjugovány na sulfáty a glukuronidy, které již nejsou biologicky aktivní a vzhledem ke své vyšší rozpustnosti ve vodě jsou následně vyloučeny močí. Pro vyhodnocení environmentální expozice endokrinním disruptorům se využívá stanovení koncentrace konjugovaných ED, případně celkové koncentrace ED (konjugovaných a nekonjugovaných ED). Cílem této práce bylo porovnat čtyři přístupy dekonjugačních reakcí - chemickou dekonjugaci pomocí trimethylchlorsilanu (TMCS) a enzymatickou dekonjugaci s využitím tří vybraných β-glukuronidas pro stanovení vybraných ED (bisfenoly, parabeny, fytoestrogeny) v plasmě. Byly použity β-glukuronidasy izolované z Helix pomatia typ HP-2 a H-5 a β-glukuronidasa z Patella vulgata. Koncentrace dekonjugovaných ED byly stanoveny pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí. Společně s vybranými ED byla vyhodnocována míra dekonjugace konjugovaných estrogenů. Nejlepších výsledků bylo dosaženo pomocí TMCS, který s velkou účinností štěpil sulfáty. Glukuronidy byly nejlépe štěpeny β-glukuronidasou z Helix...

Every organism is exposed to a number of anthropogenic chemicals from the environment that might have adverse endocrine aktivity. These substances are called endocrine disruptors (ED). In the organism are EDs active in their free form, while passing throught the liver they are conjugated to sulfates and glucuronides from the most part and are not biologically active anymore and, due to their higher solubility in water, are subsequently eliminated by urine. To evaluate environmental exposure to EDs determination of concentration of conjugated EDs or total concentration of EDs (conjugated + unconjugated) is used. The aim of this bachelor's thesis was to compare four approaches to deconjugation reactions - chemical deconjugation using trimethylchlorsilane (TMCS) and enzymatic deconjugation using three β-glucuronidases for the determination of selected EDs (bisphenols, parabens, phytoestrogens) in plasma. β-glucuronidases isolated from Helix pomatia, type HP-2 and H-5 and β-glucuronidase from Patella vulgata were tested. Concentrations of deconjugated EDs were determined using liquid chromatography with tandem mass detection (LC-MS/MS). Efficiency of deconjugation of estrogen conjugates was evaluated as well. The best results were achieved with TMCS, which cleaved sulfates with great efficiency....