Vývoj zařízení pro obohacení specifických DNA frakcí na principu preparativní gelové elektroforézy

Abstract

The presented thesis focuses on the development of a new device for preparative gel electrophoresis, for applications in clinical practice, more specifically in the field of cancer genomics, for the enrichment of separated DNA fractions. The aim is to improve the quality of subsequent DNA analyses and thus contribute to cancer research diagnosis. A mixed agarose gel matrix was used in the development of the method for maximum resolution while suppressing unwanted effects of electroosmosis inside the gel. After initial experiments with the extraction of fragments from a classic gel, a two- dimensional separation method was first implemented, where the mixture of fragments is first separated in one direction and then the voltage (or the gel plate) is rotated by 90 degrees, and the separation of pre- separated fractions continues in the other direction and is finally concluded by collection within prepared wells. Subsequently, this concept was further developed, when instead of a gel plate, several microfluidic cartridges containing orthogonally arranged channels filled with a gel matrix were introduced in successive development steps. The cassettes were manufactured using the 3D printing method with gradual improvements in functionality. In addition to the main part of the cassette (separator),...

Tato diplomová práce se zaměřuje na vývoj nového zařízení pro preparativní gelovou elektroforézu, které by bylo využitelné v klinické praxi, konkrétně v oblasti nádorové genomiky, pro obohacení separovaných frakcí DNA.Cílem je zlepšit kvalitu následných analýz DNA a tím přispět k lepší diagnostice a výzkumu nádorů. V rámci vývoje metody byla použita směsná agarózová gelová matrice pro maximální rozlišení za současného potlačení nežádoucí elektroosmózy uvnitř gelu. Po počátečních experimentech s extrakcí fragmentů z klasického gelu byla nejprve implementována metoda dvojrozměrné separace, kdy je směs fragmentů nejprve dělena v jednom směru a následně je napětí (respektive gelová deska) otočena o 90 stupňů a pokračuje separace před rozdělených frakcí a jejich namigrování do připravených jímacích jamek v druhém směru. Následně byl tento koncept dále rozvinut, kdy místo gelové desky bylo v postupných vývojových krocích představeno několik mikrofluidních kazet obsahujících ortogonálně uspořádaných kanálků naplněných gelovou matricí. Kazety byly vyrobeny metodou 3D tisku s postupným vylepšením funkčnosti. Kromě hlavní části kazety (separátoru) byly též vyvinuty vedlejší části (rámeček a hřeben) používané při přípravě kazety. K testování a optimalizaci preparace směsí DNA fragmentů byly použity dva...