Vliv hemu na ubikvitinaci proteinu p53

Abstract

6 Abstract The p53 protein is among the key tumor suppressor proteins in the human body. Its functions, such as the regulation of cell division and the induction of apoptosis, make it a protein that governs vital cellular processes. On the other hand, an increased concentration of this protein may pose a risk to the cell. Therefore, it is essential that its levels are carefully regulated. Protein degradation occurs primarily through ubiquitination. The investigation of the p53 protein ubiquitination reaction was one of the main objectives of this thesis. For this study, it was necessary to prepare the components required for the ubiquitination reaction. First, the plasmid pGEX-6P-2-MDM2 was prepared, which was then used for the expression of this protein crucial for ubiquitination. The method for isolating MDM2 was optimized, and ultimately, MDM2 protein was successfully isolated at a final concentration of 89.1 µM. Other proteins necessary for ubiquitination, namely ubiquitin and the E2 ligase, were also successfully obtained in sufficient quantity and purity within the scope of this thesis. In contrast, the p53 protein could not be isolated with satisfactory yield; however, fortunately, this protein was available in our laboratory from previous studies. A major contribution of this work is the...

5 Abstrakt Protein p53 patří mezi klíčové tumor-supresorové proteiny lidského organismu. Jeho funkce, jako například regulace buněčného dělení nebo indukce apoptózy, z něj činí protein řídicí životně důležité buněčné procesy. Na druhé straně však může zvýšená koncentrace tohoto proteinu představovat pro buňku riziko. Je proto nezbytné, aby byla jeho hladina pečlivě regulována. Degradace proteinu probíhá především prostřednictvím ubikvitinace. Zkoumání ubikvitinační reakce p53 proteinu bylo jedním z hlavních cílů předkládané diplomové práce. Pro toto studium bylo nutné připravit složky potřebné pro ubikvitinační reakci. Nejprve byl připraven plasmid pGEX-6P-2-MDM2, který byl pak využit pro expresi tohoto pro ubikvitinaci klíčového proteinu. Metoda izolace MDM2 byla optimalizována a v závěru se podařilo izolovat MDM2 protein s finální koncentrací 89,1 µM. Také další proteiny nezbytné pro ubikvitinaci, tedy ubikvitin a E2 ligasu, se podařilo v rámci této diplomové práce získat v dostatečném množství a čistotě. Naopak protein p53 se nepodařilo izolovat s uspokojivým výtěžkem, ale naštěstí byl tento protein k dispozici v naší laboratoři z předchozích studií. Zásadním přínosem této práce je pak optimalizace podmínek ubikvitinační reakce proteinu p53 a studium vlivu různých koncentrací hemu na tento proces....