Příprava a charakterizace průtokových reaktoru pro validaci biologických léčiv

Abstract

The aim of this thesis was to develop and characterize flow-through reactors based on the immobilization of alternative aspartic proteases-mucorpepsin and rhizopuspepsin-and to evaluate their applicability for the digestion of model proteins and the therapeutic monoclonal antibody Trastuzumab. These proteases, derived from filamentous fungi, were selected for their ability to efficiently cleave proteins under acidic conditions and in the presence of denaturing or reducing agents, making them suitable for proteomic applications and structural analyses. In the experimental part, the proteolytic activity of both enzymes was first analyzed using SDS- PAGE under varying pH conditions and in the presence of TCEP and denaturing agents. The results showed that the optimal pH for both proteases ranged between 2.5 and 4.0, with mucorpepsin displaying higher substrate selectivity compared to the more unspecific cleavage pattern of rhizopuspepsin. Enzymatic efficiency was further confirmed by LC-MS/MS analysis, which provided detailed data on sequence coverage, the number of unique peptides, and cleavage site preferences. Flow-through reactors with immobilized enzymes on POROS™ 20 AL resin were prepared and tested for their ability to digest selected proteins. The best results for Trastuzumab digestion in the...

Cílem této diplomové práce bylo připravit a charakterizovat průtokové reaktory založené na imobilizaci alternativních aspartátových proteáz - mucorpepsinu a rhizopuspepsinu - a otestovat jejich využitelnost při štěpení modelových proteinů a terapeutické monoklonální protilátky Trastuzumabu. Tyto proteázy pocházející z vláknitých hub byly vybrány díky své schopnosti efektivně štěpit proteiny za kyselých podmínek a za přítomnosti denaturačních či redukčních činidel, což je činí vhodnými pro proteomické aplikace a strukturní analýzy. V experimentální části byla nejprve analyzována proteolytická aktivita obou enzymů v závislosti na pH, přídavku TCEP a denaturačních činidel pomocí SDS-PAGE. Výsledky ukázaly, že optimální pH aktivity obou proteáz se pohybuje mezi 2,5 a 4,0, přičemž mucorpepsin vykazoval vyšší substrátovou selektivitu než rhizopuspepsin. Následně byla enzymatická účinnost potvrzena LC-MS/MS analýzou, která poskytla detailní informace o pokrytí sekvence, počtu unikátních peptidů a preferencích štěpení. Byly připraveny průtokové reaktory s imobilizovanými enzymy na nosič POROS™ 20 AL a testována jejich účinnost při štěpení vybraných proteinů. Nejlepších výsledků při štěpení Trastuzumabu v průtokovém formátu bylo dosaženo s mucorpepsinem při pH 3,5 a 25 řC po přídavku TCEPu. Práce ukazuje...