Development and Validation of a Novel Fluorescent Sensor of the Sphingosine-1-phosphate Receptor 1

Abstract

4 Abstrakt (česky) Receptory spražene s G-proteiny (GPCRs) tvorí rožsahlou rodinu membranovych receptoru, ktere regulují životu esencialní fyžiologicke procesy díky sve klícove roli v bunecne signaližaci. Jedním ž GPCR je Sfingosin-1-fosfatovy receptor 1, ktery reguluje radu bunecnych procesu ve vaskularním a imunitním systemu. S1PR1 je žasadní pro migraci lymfocytu ž lymfatickych užlin do lymfatickeho obehu a podílí se na vyvoji a udržovaní integrity krevních cev. Díky sve roli v migraci T-bunek predstavuje S1PR1 atraktivní cíl pro lecbu autoimunitních onemocnení. I pres duležitost S1PR1, spolehlive sensory pro studovaní jeho aktivity nejsou dostupne. Geneticky kodovane fluorescencní senžory žaložene na cirkularne permutovanem GFP (cpGFP) predstavují inovativní prístup k monitorovaní aktivity GPCR. Fluorescence cpGFP se mení v žavislosti na konformacních žmenach daneho GPCR, což umožnuje intenžiometricke sledovaní jeho aktivity. . Tyto senžory umožnují neinvaživní sledovaní žmen konformace receptoru pri jejich aktivaci. Nasím cílem bylo navrhnout a vytvorit fluorescencní senžor specificky pro S1PR1 prostrednictvím molekularních biologickych metod. Senžor byl nasledne charakterižovan v bunecních linií HEK293T a NIH-3T3. V dalsí faži byla testovana reaktivita senžoru vuci ružnym ligandum S1PR1. Nakonec se...

5 Abstrakt (anglicky) G-protein-coupled receptors (GPCRs) form a large family of membrane receptors that regulate essential physiological processes due to their pivotal role in cellular signaling. One of the GPCRs is the sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) which regulates numerous cellular processes within the vascular and immune systems. S1PR1 plays a role in the development and maintenance of blood vessel integrity and is crucial for the migration of lymphocytes from lymph nodes into lymphatic circulation. For instance, due to its role in T-cell migration, S1PR1 represents an attractive target for the treatment of autoimmune diseases. Despite the importance of S1PR1, reliable sensors for studying its activity are not available. Genetically encoded fluorescent sensors based on circularly permuted GFP (cpGFP) offer an innovative approach to monitoring GPCR activity. CpGFP fluorescence changes depending on the activation and conformational changes of the given GPCR, enabling intensiometric measurements of GPCR activity. These sensors allow for non-invasive tracking of receptor conformational changes during activation. Our goal was to design and develop a fluorescent sensor specific to S1PR1 using molecular biology techniques. In the subsequent validation phase, we tested the responsiveness of this...