Modified nucleotides and DNA bearing reactive groups for bioconjugation and cross-linking with aminoacids

Abstract

ABSTRAKTNÍ Tato disertační práce je rozdělena do čtyř částí popisující vývoj a syntézu nukleotidů a DNA nesoucích různé reaktivní skupiny pro spojování s aminokyselinami a peptidy. První část zahrnuje návrh a syntézu několika 2'-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTP) a DNA- reaktivních sond nesoucích deriváty 2-/4-trans-cyklooktenu (TCO) či bicyklononynu (BCN) vázané buď přes kratší propargylkarbamát nebo delší spojku na bázi triethyleneglykolu pro značení tetraziny pomocí IEDDA reakce jak in vitro, tak i v buňkách. Obecná strategie byla založena na derivatizaci polohy 5 u pyrimidinů pomocí vodné Sonogashira reakce s propargylaminovým linkerem a následnou nukleofilní substitucí s reaktivními deriváty TCO nebo BCN poskytující příslušný modifikovaný 2'-deoxycytidin monofosfát (dCMPs) a trifosfáty (dCTPs). Následujícím krokem bylo enzymové začlenění takto funkcionalizovaných dCTPs do DNA prostřednictvím metody prodlužování primeru (PEX). Derivát 4-trans-TCO-dCMP byl použit pro modelovou reakci s 3,6- dipyridyltetrazinem za účelem potvrzení vzniku příslušného konjugátu pomocí NMR analýzy. Současně byla snímána interakce všech modifikovaných dCTPs s nadbytkem různých tetrazinů ve vodném roztoku vedoucí ke zvýšení intenzity fluorescence vzniklých konjugátů. V dalším kroku byly úspěšně provedeny reakce...

This PhD thesis is divided in four parts describing the development and the synthesis of nucleotides and DNA-reactive probes bearing different reactive groups for bio-imaging, bioconjugation and cross-linking with aminoacids and peptides. The first part regarding the design and synthesis of a series of 2'-deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) and DNA-reactive probes bearing 2- or 4- linked trans-cyclooctene (TCO) or bicyclononyne (BCN) tethered through a shorter propargylcarbamate or longer triethyleneglycol-based spacer for in vitro and in cellulo labeling with various tetrazines by IEDDA reaction. The general strategy was based on the functionalization of the position 5 of pyrimidines via acqueous Sonogashira coupling with propargylamino linker and then addition of reactive building block bearing TCO or BCN by nucleophilic substitution to synthetize modified 2'-deoxycitidine monophosphate (dCMP) and triphosphates (dCTPs). The following step was enzymatic incorporation of such functionalized dCTPs into DNA via primer extension (PEX). The 4- linked TCO monophosphate derivative was used, as model compound, for reaction with 3,6- dipyridyl tetrazine to prove the formation of the conjugate by NMR analysis. In parallel, the reactivity of all functionalized triphosphates with excess of various...