Characterisation of protein structure using covalent and radical techniques in combination with mass spectrometry

Abstract

Biologické procesy jsou často spojené se strukturou a dynamikou biomakromolekul. Jedny z hlavních bimakromelkul jsou proteiny, jejichž struktura a dynamika je komplikovaná a je zapotřebí speciální přístupy pro jejich objasnění. Mezi hlavní přístupy pro řešení stuktury proteinů patří X-ray krystalografie, NMR a Cryo-EM, které pracují s velmi vysokým rozlišením a poskytují informaci na atomární úrovni. Nicméně, jejich použití je poměrně limitované, proto je nutné vyvíjet další metody strukturní biologie. Metody strukturní proteomiky pracují s nižším rozlišením než zmíněné metody, nicméně, mají velmi široké spektrum použití. Jedny z hlavních technik strukturní proteomiky jsou vodík-deuteriová výměna, kovalentní/radikálové značení a chemické zesítění. Předmětem této práce bylo vyvinout novou metodu radikálového značení a ověřit aplikaci na komplexnějších proteinech, jako jsou protilátky, proteinové komplexy a membránové proteiny. Radikálové značení je nová technologie a je reprezentována metodou rychlé fotochemické oxidace proteinů. Nicméně, tato technika využívá laserů, které pro vyvíjenou metodou nebyly žádoucí. Jako zdroj radikálů byla vybrána Togniho činidla primáně využívána v organické syntéze. Radikály jsou iniciovány pomocí kyseliny askorbové a reagují primárně s aromatickými aminokyselinami a...

Biological processes are often associated with the structure and dynamics of biomacromolecules. One of the main biomacromolecules are proteins, whose structure and dynamics are complex and require special approaches. The main approaches for resolving protein structures include X-ray crystallography, NMR, and Cryo-EM, which work with very high resolution and provide information at the atomic level. However, their use is relatively limited, thus the development of other structural biology methods is necessary. Structural proteomics methods operate with lower resolution than the mentioned methods but have a wide range of applications. Some of the main techniques of structural proteomics are hydrogen- deuterium exchange, covalent/radical labeling, and chemical cross-linking. The aim of this work was to develop a new method of radical labeling and verify its application on more complex proteins, such as antibodies, protein complexes, and membrane proteins. Radical labeling is a new technology represented by FFAP. However, this technique uses lasers, which were not desirable for the developed method. Togni reagents, primarily used in organic synthesis, were selected as the source of radicals. Radicals are initiated by ascorbic acid and primarily react with aromatic amino acids and free cysteines. This...