Functional significance of DHX38 in pre-mRNA splicing and its role in the mechanism of retinitis pigmentosa

Abstract

Retinitis pigmentosa (RP) je oční porucha, která postihuje přibližně dva miliony lidí po celém světě. V této práci jsme analyzovali vliv záměny aminokyselin v RNA helikáze DHX38 (Prp16), která způsobuje RP. V kvasinkách byla Prp16 identifikována jako helikáza nezbytná pro druhý krok sestřihu. Naše výzkumy ukázaly interakci DHX38 s klíčovými složkami sestřihu relevantními pro oba kroky sestřihu, i když jsme nepozorovali, že by mutace způsobující RP tyto interakce měnila. Poté jsme snížili expresi DHX38 a sledovali změny v sestřihu. Zatímco jsme zaznamenali pouze menší změny v celkovém sestřihu, detekovali jsme 71 změněných alternativních sestřihových událostí. Dále jsme zkoumali roli DHX38 v sestřihu genů specifických pro sítnici. Naše výsledky ukázaly závislost sestřihu FSCN2 na DHX38. Dále jsme zjistili, že DHX38 RP varianta inhibuje sestřih RHO. Nakonec jsme ukázali, že nadměrná exprese DHX38 podporuje použití jak kanonických, tak kryptických 5' sestřihových míst v HBB sestřihovém reportéru. Souhrně naše data ukazují, že DHX38 je sestřihový faktor, který podporuje sestřih kryptických sestřihových míst a je zapojen do alternativního sestřihu. Navíc poskytujeme důkazy naznačující, že substituce G332D spojená s RP ovlivňuje sestřihovou aktivitu DHX38.

Retinitis pigmentosa (RP) is an eye disorder impacting around two million people worldwide. In this work, we analyzed the effect of an amino acid substitution within the RNA helicase DHX38 (Prp16), which gives rise to RP. In yeast, Prp16 has been identified as a helicase necessary for the second step of splicing. Our research showed DHX38's interaction with crucial splicing components relevant to both steps of splicing, although we did not observe that the RP mutation changes these interactions. We then downregulated DHX38 and monitored splicing changes. While we noted only minor changes in overall splicing, we detected 71 altered alternative splicing events. We then investigated the role of DHX38 in the splicing of genes specific to the retina. Our results spotlighted the dependence of FSCN2 splicing on DHX38. Intriguingly, the DHX38 RP variant exhibited an inhibition on RHO splicing. Lastly, we showed that the overexpression of DHX38 promoted the usage of both canonical and cryptic 5' splice sites within the HBB splicing reporter. In summary, our data show that DHX38 is a splicing factor that promotes the splicing of cryptic splice sites and it is involved in alternative splicing. Furthermore, we provide evidence suggesting that the RP-associated substitution G332D influences the splicing...