Molecular mechanisms of MICAL activation in axon guidance

Abstract

Axonální navigace je klíčová pro vývoj nervové soustavy a závisí na navigačních signálech a přestavbách cytoskeletu. Semaphoriny, důležité navigační molekuly, signalizují přes plexinové receptory a ovlivňují navádění růstových kuželů. Po navázání se plexiny dimerizují a aktivují se. Proteiny MICAL jsou potenciální efektory schopné oxidovat aktin a indukovat rozpad jeho filament. Mechanismy spojující aktivaci plexinů s přestavbou cytoskeletu zprostředkovanou MICAL však zůstávají nejasné. Tato práce se zaměřila na objasnění přímé interakce mezi cytosolickými doménami plexinů a proteiny MICAL pomocí biofyzikálních metod. Navrhli jsme monomerní a dimerní konstrukty cytosolických domén PlexinA z Drosophily a člověka, napodobující neaktivní a aktivní stavy receptoru. Pomocí povrchové rezonance plazmonu jsme měřili vazbu mezi plexiny a proteiny MICAL. Překvapivě naše experimenty neodhalily žádnou specifickou vazbu mezi plexiny a MICAL. Pozorovali jsme však interakci mezi MICAL-1 a Rab8 s disociačními konstantami 0,25 μM a 4 μM pro dvě vazebná místa. Tyto nálezy naznačují, že interakce plexin-MICAL může vyžadovat další buněčné faktory nebo modifikace. Případně naše výsledky naznačují, že nepřímé metody použité v předchozích studiích mohly vést k nesprávným závěrům o interakci plexinu a MICALu. Naše práce...

Axon guidance is crucial for neural development, relying on guidance cues and cytoskeletal rearrangements. Semaphorins, important guidance cues, signal through plexin receptors to influence growth cone navigation. Upon binding, plexins dimerize and activate. MICAL proteins are potential effectors, capable of oxidizing actin and inducing filament disassembly. However, mechanisms linking plexin activation to MICAL- mediated cytoskeletal remodelling remain elusive. This thesis aimed to elucidate the direct interaction between plexin cytoplasmic domains and MICAL proteins using biophysical methods. We designed monomeric and dimeric constructs of Drosophila and human PlexinA cytoplasmic domains, mimicking inactive and active receptor states. Surface plasmon resonance experiments measured binding between plexin and MICAL proteins. Surprisingly, our assays detected no specific binding between plexins and MICALs. However, we observed interaction between MICAL-1 and Rab8, another plexin activator, with dissociation constants of 0.25 μM and 4 μM for two binding sites. These findings suggest that plexin-MICAL interaction may require additional cellular factors or modifications. Alternatively, our results raise the possibility that indirect methods in previous studies led to incorrect conclusions about...