Structural insights into 14-3-3 dependent regulation of ubiquitin ligase Nedd4-2

Abstract

The journey of an eukaryotic protein typically begins in a ribosome and ends in a proteasome. What happens in between is a great diversity of functions that makes life possible, but the fate of most proteins is to be eventually degraded. A key components in this process are ubiquitin ligases. This thesis aims to provide more insight into the molecular basis of regulation of one such protein, the Nedd4-2. Nedd4-2 is a member of the Nedd4 subfamily within the HECT family of ubiquitin ligases. Its most famous ubiquitination target is the Epithelial sodium channel, ENaC. It was reported that 14-3-3 protein and calcium modulate this and other interactions of Nedd4-2, but many questions remain to be answered about the structural basis of this regulation. Aiming to bring more insight at the molecular level, we performed measurements of small-angle x-ray scattering, analytical ultracentrifugation and hydrogen-deuterium exchange. Our conclusions bring new understanding in the area of ubiquitin ligases and for example can be applied in the new promising field of PROTAC drug design. Keywords: Nedd4-2, 14-3-3 protein, calcium, protein interactions

Cesta eukaryotického proteinu obvykle začíná v ribozomu a končí v proteazomu. To, co se odehrává mezi tím, představuje velkou rozmanitost funkcí, které umožňují život, ale osudem většiny proteinů je, že jsou nakonec rozloženy. Klíčovou součástí tohoto procesu jsou ubikvitinové ligázy. Cílem této práce je poskytnout bližší vhled do molekulární podstaty regulace jednoho takového proteinu, Nedd4-2. Nedd4-2 je členem podrodiny Nedd4 v rámci rodiny ubikvitinových ligáz HECT. Jeho nejznámějším cílem ubikvitinace je epitelový sodíkový kanál ENaC. Bylo zjištěno, že 14-3-3 protein a vápník modulují tuto a další interakce Nedd4-2, ale stále zbývá zodpovědět mnoho otázek týkající se strukturní podstaty této regulace. S cílem přinést více poznatků na molekulární úrovni jsme provedli měření pomocí maloúhlového rozptylu rentgenového záření, analytické ultracentrifugace a vodíko- deuteriové výměny. Naše závěry přinášejí nové poznatky v oblasti ubikvitinových ligáz a lze je například uplatnit v nové perspektivní oblasti návrhu léčiv typu PRO- TAC. Klíčová slova: Nedd4-2, protein 14-3-3, vápník, interakce proteinů