Large Extracellular Vesicles in Cell Culture and Blood: Role in Prion Transmission and Detection by Flow Cytometry
Velké extracelulární vezikuly v buněčné kultuře a krvi: role v přenosu prionů a detekce průtokovou cytometrií
rigorous thesis (RECOGNIZED)
View/ Open
Permanent link
http://hdl.handle.net/20.500.11956/187004Identifiers
Study Information System: 265209
Collections
- Kvalifikační práce [20084]
Author
Faculty / Institute
Faculty of Science
Discipline
Genetics, Molecular Biology and Virology
Department
Department of Genetics and Microbiology
Date of defense
20. 11. 2023
Publisher
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaLanguage
English
Grade
Recognized
Keywords (Czech)
Prion, Extracelulární vezikuly, Exosomy, Mikrovezikuly, PrP, Buněčná kultura, Průtoková cytometrie, Krevní plazmaKeywords (English)
Prion, Extracellular Vesicles, Exosomes, Microvesicles, PrP, Cell Culture, Flow Cytometry, Blood PlasmaPriony (PrP) jsou hlavní příčinou neurodegenerativních onemocnění jako je ovčí klusavka, bovinní spongiformní encefalopatie, chronické strádání jelenovité zvěře a lidská Creutzdfeld- Jacobova choroba. Přestože se buněčný PrP (PrPC ) účastní mnoha buněčných procesů, jeho přesná funkce není dosud známá. Onemocnění vzniká akumulací patologické formy PrP (PrPTSE ), která vzniká přímým kontaktem PrPTSE a PrPC . PrP je ukotvený v membráně pomocní GPI a může být přenášen mezi buňkami kontaktem, tzv. "tunnelling nanotubes" nebo extracelulárními vezikuly (EV). Frakce EV se dělí na exosomy, mikrovezikuly a apoptotická tělíska rozdílnou biogenezí. PrPTSE se nachází v exosomech a mikrovezikulech, ale tyto frakce EV nikdy nebyly mezi sebou porovnány. Prvním cílem dizertační práce je porovnat obsah PrP, prion konvertující aktivitu a infektivitu v těchto frakcích EV na CAD5 a N2a-PK1 buněčných modelech infekce. Centrifugací jsme izolovali frakci velkých EV (20 000× g) a malých EV (110 000× g) z kondiciovaného média. EV jsme charakterizovali pomocí kryo-elektronové mikroskopie a western blotem s markery Alix, TSG-101, CD63, CD9 a HSP70. Kontaminace z jiných buněčných kompartmentů byla ověřena kalnexinem. Frakce EV se mezi sebou lišili obsahem β-1 integrinu. Malé EV mají sníženou a velké EV mají zvýšenou hladinu...
Prions (PrP) are the main cause of neurodegenerative diseases such as Scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy, chronic wasting disease in deer, and Creutzfeldt-Jakob disease in humans. Although the cellular PrP (PrPC ) is involved in many cellular processes, its precise function still needs to be discovered. The disease is caused by the accumulation of a pathological form of PrP (PrPTSE ), which is caused by direct contact of PrPTSE and PrPC . PrP is anchored in the membrane by GPI and can be transmitted by cell-to-cell contact, tunnelling nanotubes, or extracellular vesicles (EVs). EV factions are divided by different biogenesis into exosomes, microvesicles, and apoptotic bodies. PrPTSE was found in exosomes and microvesicles, but these fractions were never compared to each other. The first aim of the doctoral thesis is a comparison of PrP content, prion-converting activity and infectivity in these fractions on CAD5 and N2a-PK1 cellular models of infection. We isolated a fraction of large EVs (20,000× g) and small EVs (110,000× g) by centrifugation from a conditioned medium. We characterised EVs by cryo-electron microscopy and western blot with Alix, TSG-101, CD63, CD9, and HSP70 markers. The contamination from other cellular compartments was checked by calnexin. EV fractions differed...