Příprava organelových markerů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

Abstract

The aim of the work was to prepare a set of strains with fluorescently labelled organelles. The organism used is a haploid strain with a high frequency of homologous recombination Saccharomyces cerevisiae BY4742. The yeast S. cerevisiae is a unicellular organism and is one of the most studied experimental living systems. Its generation time tends to be 1.5-2 hours, which allows rapid monitoring of culture development on both solid and liquid media. For each organelle, specific proteins were selected, namely proteins localized on the vacuole membrane (Vph1, Vtc3), peroxisomes (Pex3), nucleus (Nvj1), endoplasmic reticulum (Sec63), mitochondria (Cox4) and in the vacuole lumen (Prc1). Selected proteins were labeled by attaching fluorescent proteins (yEGFP, yomCherry or yomRuby2) to their C-termini. The prepared strains were analyzed in liquid and solid media. Growth curves were constructed, fluorescence at different growth stages was compared and the effect of two different carbon sources on the expression of selected genes was determined. A total of 12 strains with fluorescent organelle markers for the vacuolar membrane, peroxisomes, nucleus, endoplasmic reticulum, mitochondria, and vacuolar lumen and 5 strains with a pair of fluorescent markers for vacuolar membrane and selected other organelle...

Cílem práce bylo připravit sadu kmenů s fluorescenčně značenými organelami. Použitým organismem je haploidní kmen s vysokou frekvencí homologní rekombinace Saccharomyces cerevisiae BY4742. Kvasinka S. cerevisiae je jednobuněčný organizmus a patří mezi nejstudovanější experimentální živé systémy. Její generační doba bývá 1,5-2 hodiny, což umožňuje rychle sledovat vývin kultury jak na pevném, tak i v tekutém médiu. Pro každou organelu byly vybrány specifické proteiny, a to proteiny lokalizované na membráně vakuol (Vph1, Vtc3), peroxisomů (Pex3), jádra (Nvj1), endoplazmatického retikula (Sec63), mitochondrií (Cox4) a v lumen vakuol (Prc1). Vybrané proteiny byly označené připojením fluorescenčních proteinů (yEGFP, yomCherry nebo yomRuby2) k jejich C-koncům. Připravené kmeny byly analyzované v tekutých a na pevných médiích. Byly sestrojené růstové křivky, porovnána fluorescence v různých fázích růstu a zjištěn vliv dvou různých zdrojů uhlíku na expresi vybraných genů. Celkem bylo připraveno a otestováno 12 kmenů s fluorescenčními organelovými markery pro membránu vakuol, peroxisomů, jádra, endoplazmatického retikula, mitochondrií a vakuolární lumen a dále 5 kmenů s dvojicí fluorescenčních markerů pro vakuolární membránu a vybranou další organelu (membránu peroxisomů, jádra, endoplazmatického retikula,...