Kinases regulating AP2 complex phosphorylation in Caenorhabditis elegans

Abstract

Heterotetrameric adaptor protein 2 complex (AP2) is a fundamental component of clathrin-coated pits playing a part in every step of clathrin-coated vesicle generation. Although the mechanism of AP2 function has been extensively studied for no less than 20 years, the exact role of the regulatory phosphorylation on T156 of its μ2 subunit remains unclear. The main kinase responsible for the T156 phosphorylation in mammals is AAK1; however, many observations suggest that other kinases collaborate on this event. The aim of this project is to shed light on the importance of AP2 phosphorylation in Caenorhabditis elegans and elucidate the function of SEL-5/AAK1 kinase. To determine the relationship between SEL-5/AAK1, AP2 phosphorylation, and the function of endocytosis, we used a combination of phenotype analysis of C. elegans transgenic lines and in vitro assays. We showed that DPY-23, the C. elegans μ2 subunit, is phosphorylated analogously to its human orthologue. We confirmed that DPY-23 phosphorylation depends on SEL-5, yet we were not able to prove the kinase activity of SEL-5 directly. Interestingly, our results further revealed that DPY-23 phosphorylation is dispensable for the endocytosis of a model cargo, and we also showed that interaction motifs located outside the kinase domain of SEL-5 are...

Heterotetramerní adaptorový proteinový komplex 2 (AP2) je podstatnou součástí klatrinových jamek hrající roli v každém kroku procesu tvorby klatrinového váčku. Přestože je mechanismus funkce AP2 intenzivně studován již více než 20 let, přesná role regulační fosforylace na T156 jeho podjednotky μ2 zůstává nejasná. Hlavní kinázou zodpovědnou za fosforylaci T156 u savců je AAK1, nicméně mnohá pozorování naznačují, že se této události účastní i další kinázy. Cílem této práce je popsat důležitost fosforylace AP2 u Caenorhabditis elegans a objasnit funkci kinázy SEL-5/AAK1. Ke studiu vztahu mezi SEL-5/AAK1, fosforylací AP2 a funkčností endocytózy jsme využili kombinaci analýzy fenotypů transgenních linií C. elegans s in vitro přístupy. Ukázali jsme, že DPY-23, podjednotka μ2 u C. elegans, je fosforylována analogicky ke svému ortologu u člověka, nebyli jsme však schopni přímo prokázat kinázovou aktivitu SEL-5, přestože jsme potvrdili, že fosforylace DPY-23 na SEL-5 závisí. Naše výsledky dále odhalily, že fosforylace DPY-23 je postradatelná pro endocytózu modelového karga, a ukázali jsme, že interakční motivy ležící mimo kinázovou doménu SEL-5 jsou důležité pro její funkci. Pro určení vazebných partnerů SEL-5/AAK1, pro které jsou tyto motivy klíčové, a procesu, který s touto spoluprací souvisí, je však...