Production of human milk oligosaccharides in the cell factory of E. coli

Abstract

Human milk oligosaccharides (HMOs) are among the most abundant components of human breast milk and are essential for the development of neonatal health. It is very challenging to isolate these oligosaccharides from animal milk, especially the less abundant ones. Therefore, different approaches are to be sought after. Chemical and enzymatic syntheses of these compounds are labor-intensive, and expensive affording low yields. A newly adopted approach to HMO synthesis is through bac- terial cell factories, in which genetically engineered bacterial strains can use cheap carbohydrate substrates and convert them into specific oligosaccharides. The aim of this thesis is to examine the feasibility of using selected bacterial strain (E. coli) for the production of HMOs. With lactose as a glycan substrate, the bacterial host has to be β-galactosidase deficient, otherwise, the substrate would be degraded. In order to generate higher lactose intake in the cell, a crp gene that encodes for the positive transcriptional regulator (Catabolite Activator Protein - CAP) can be incorporated into the host organism. The cloned plasmid - pRSFDuet- 1-crp was used for the transformation of into the selected bacterial strain. Lactose from the cells was purified by gel chromatography and the influence of CAP over expression...

Oligosacharidy lidského mléka patří mezi nejhojnější složky mateřského mléka a jsou nezbytné pro zdravý vývoj novorozence. Izolovat tyto oligosacharidy z živočišného mléka, zejména ty méně hojné, je velmi náročné, a proto je třeba hledat nové způsoby získání těchto látek. Chemické a enzymové syntézy těchto sloučenin jsou pracné a nákladné a poskytují nízké výtěžky. Inovativním přístupem k syntéze HMO jsou bakteriální buněčné továrny, v nichž geneticky upravené bakteriální kmeny mohou využívat levné sacharidy jako substráty a přeměňovat je na specifické oligosacharidy. Cílem této práce je prozkoumat možnosti využití vybraných bakteriálních kmenů (E. coli) pro produkci oligosacharidů lidského mléka. U laktosy jako sacharidového substrátu musí být bakteriální hostitel deficientní na β-galaktosidasu, jinak by byl substrát degradován. Pro zýšení příjmu laktózy v buňce lze do hostitelského organ- ismu vnést gen crp, který kóduje pozitivní transkripční regulátor (Catabolite Acti- vator Protein - CAP). Klonovaný plazmid - pRSFDuet-1-crp byl transformován do vybraného bakteriálního kmene. Laktóza z buněk byla purifikována gelovou chro- matografií a vliv zvýšené exprese CAP na příjem laktózy do buněk byl analyzován pomocí různých analytických metod, jako je TLC, HPLC a komerční laktózový test. Klíčová slova:...