On-line derivatizace sacharidů v kapilární elektroforéze

Abstract

Saccharides chains may suffer from various inaccuracies during their biosy- thesis, that effects their biologic functions. Therefore, they can be used for dia- gnosis of some diseases or quality control in biopharmaceutics. Capillary electro- phoresis has its place in diagnosing these occuring errors. In this thesis a method of on-line derivatization of saccharides in fused-silica capillary with 50 cm in lenght and 50 µm in inner diameter was developed. Gluco- se was used as a model molecule, which was labeled by a fluorescent derivatization reagent, 7-aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid. Derivatization of glucose and its separation needed optimalization. First was determined an electrophoretic mo- bility of the derivatization reagent in 0.5; 1.0 and 2.5M acetic acid and 20mM phosphate buffer (pH = 3.5). Both, 2.5M acetic acid and 20mM phosphate buffer, were tested as solvents for 7-aminonaphthalene-1,3-disulfonic acid. The reaction with glucose was the best in acetic acid solution. On the contrary, phosphate buf- fer was found to be the best background electrolyte for the separation. Derivatized glucose was detected by UV detector at 229 nm. Henceforth, the reaction con- ditions were adjusted such as reaction time, voltage and time of its application. Input voltage was applied negative due to the...

Sacharidové řetězce glykoproteinů mohou podléhat různým chybám při jejich bi- osyntéze, které ovlivňují jejich biologické funkce, proto jich může být využito v diagnóze některých onemocnění nebo kontrole kvality biofarmaceutik, konkrét- ně monoklonálních protilátek, které také obsahují tetramerní glykoproteiny. Při diagnóze těchto poruch má potencionální využití kapilární elektroforéza. V této práci byla vyvíjena metoda on-line derivatizace sacharidů v křemenné kapiláře o délce 50 cm a o vnitřním průměru 50 µm. Jako modelová molekula byla použita glukóza, která byla značena fluorescenčním derivatizačním činidlem, 7-aminonaftalen-1,3-disulfonovou kyselinou. Metodu derivatizace glukózy a její separaci bylo potřeba optimalizovat. Nejprve byla zjištěna elektroforetická po- hyblivost derivatizačního činidla v 0,5; 1,0 a 2,5M koncentracích kyseliny octové a v 20mM fosfátovém pufru, pH = 3,5. Jako rozpouštědlo pro 7-aminonaftalen- 1,3-disufonovou kyselinu byly vyzkoušeny 2,5M kyselina octová i 20mM fosfátový pufr se záměrem sjednotit reakční a separační prostředí, což se ukázalo jako ne- realizovatelné. Byly zjištěny efektivní pohyblivosti ve zmíněných roztocích. Nej- lépe probíhala reakce s glukózou v prostředí kyseliny octové. Pro separaci bylo zjištěno, že nejvhodnějším základním elektrolytem je naopak...