Enzymová syntéza a studium vlastností DNA modifikovaných na bázích

Abstract

The influence and specific interactions of chemical modifications in the DNA major groove have been systematically investigated for a long time. This work focuses on the enzymatic preparation of DNA bearing phenyl substituents on bases in milligram scale. For this synthesis, four 2'-deoxyribonucleoside triphosphates bearing an electron-rich phenyl group at position 7 of 7-deazapurines and at position 5 of pyrimidines (dAPhTP, dGPhTP, dCPhTP, dUPhTP) were prepared in prof. Hocek's group. The DNA polymerase KOD(exo-), which was expressed for the purpose of this work, was used to carry out the enzymatic synthesis. All four phenyl-modified 2'-deoxyribonucleoside triphosphates were successfully incorporated into the oligonucleotide chain using the primer extension and the DNA was synthesized in a milligram scale. The individual products were purified by dialysis and HPLC and their denaturation temperature was further monitored on UV-Vis spectrophotometer and their structure by spectroscopic method CD. The main objective of this and further extensive studies is mainly to understand the various biological processes and bioorthogonal reactions of macromolecules. [IN CZECH] Key words DNA, modifications, oligonucleotides, polymerases, PEX, PCR, structural analysis, CD

Vliv a specifické interakce chemických modifikací ve velkém žlábku DNA jsou dlouhodobě a systematicky zkoumány. Tato práce se zabývá enzymovou přípravou DNA nesoucí fenylové substituenty na bázích v miligramovém množství. K této syntéze jsou potřeba čtyři 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty nesoucí elektronově bohatou fenylovou skupinu v pozici 7 u 7-deazapurinů a v pozici 5 u pyrimidinů (dAPhTP, dGPhTP, dCPhTP, dUPhTP), které byly připraveny ve skupině prof. Hocka. Pro uskutečnění enzymové syntézy byla použita DNA polymerasa KOD(exo-), která byla pro účely této práce exprimována. Všechny čtyři modifikované 2'-deoxyribonukleosid trifosfáty nesoucí fenylovou skupinu byly úspěšně inkorporovány do oligonukleotidového řetězce metodou extenze primeru a DNA byla syntetizována v miligramovém měřítku. Jednotlivé produkty byly čištěny pomocí dialýzy a HPLC. Dále byla sledována jejich teplota denaturace na UV-Vis spektrofotometru a jejich struktura spektroskopickou metodou CD. Hlavním cílem těchto a budoucích studií je zejména pochopení různých biologických procesů a bioortogonálních reakcí makromolekul. Klíčová slova DNA, modifikace, oligonukleotidy, polymerasy, PEX, PCR, strukturní analýza, CD