Produkce a charakterizace lidského inhibitoru C1 a rekombinantních proteinů z Plasmodium falciparum PfMSP3.1 pro strukturní studia

Abstract

PfMSP3.1 is one of the surface proteins of the intracellular parasite Plasmodium falciparum, which causes malaria. As one of the evasion strategies of the immunity system of the human host this protein interacts with one regulator of the complement system - C1 inhibitor. Determining the exact binding site and its structural assessment would help to better understand the interaction between the parasite and the host, which is necessary for the disease progression and thus for the development of a potential therapy. In the theoretical part of the thesis, the life cycle of Plasmodium falciparum, the role of the parasite stage called merozoite, the role of its surface proteins, including merozoite surface protein 3, in the attack of red blood cells by the parasite, are described in more detail. It also briefly describes the complement system, its activation pathways and the regulation of these pathways. The experimental part includes the cloning of plasmids to produce C1 inhibitor and various forms of merozoite surface protein PfMSP3.1, transfection of S2 insect cells with these plasmids, subsequent protein expression in S2 cells and their purification. In the second half of the experimental part, we tried to create complexes of C1 inhibitor with individual PfMSP3.1 forms and an attempt to crystallize...

PfMSP3.1 je jedním z povrchových proteinů intracelulárního parazita Plasmodium falciparum, který způsobuje malárii. Protein v rámci strategie úniku parazita před imunitním systémem lidského hostitele váže jeden z regulátorů systému komplementu - C1 inhibitor. Zjištění přesného místa vazby a jeho strukturální stanovení by napomohlo k pochopení interakce mezi parazitem a hostitelem, která je důležitá pro rozvoj nemoci, a tím i pro návrh možné terapie. V teoretické části práce je přiblížen životní cyklus Plasmodia falciparum, role vývojového stádia parazita zvaného merozoit, jeho povrchových proteinů a s tím i přímo merozoitového povrchového proteinu 3 při napadání červených krvinek parazitem. Dále je v ní stručně popsán systém komplementu, jeho aktivace a regulace. Experimentální část zahrnuje klonování plasmidů pro tvorbu C1 inhibitoru a různých forem povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1, transfekci S2 hmyzích buněk těmito plasmidy, následnou expresi proteinů v S2 buňkách a jejich purifikaci. V druhé polovině experimentální části byly provedeny pokusy o vytvoření komplexů C1 inhibitoru s jednotlivými formami povrchového proteinu merozoitu PfMSP3.1 a krystalizaci tohoto proteinu. Klíčová slova Proteinová exprese, inhibice enzymů, krystalizace proteinů, malárie. komplement, C1 inhibitor