Identifikace bazolaterálních lokalizačních motivů urátového transportéru GLUT9 s využitím funkčních studií.

Abstract

The GLUT9 transporter, coded by the SLC2A9 gene, is one of the key proteins enabling the trasnfer of uric acid across the membrane in epithelial cells of the proximal tubule. In humans, this protein is naturally expressed in two variants: long (GLUT9L) and short (GLUT9S), which differ from one another by their N-terminus sequence. Each of these isoforms is localized on a different pole of the epithelial cell. The signal sequence/motif responsible for this difference is presumed to be located in the aforementioned N-terminus domain. Numerous allelic variants influencing the transport properties of the protein have also been described. The first aim of this thesis is to verify the influence of a newly discovered variant, characterized by substituting of valine for leucine in the 114th position (V114L, in the short form its corresponding variant V85L) on the ability to transport uric acid. Second aim is to verify the influence of mutations in selected motifs, which could be responsible for the localization of the protein, thus also changing its transport properties. Two dileucine motifs 12LGL14 and 33LL34 and one tyrosine motif 84YIKA87 were tested. Functional studies using 14 C radiolabeled urate demonstrated significant decrease of transport ability for the V114L/V85L allelic variant in both...

Transportér GLUT9, kódovaný genem SLC2A9, je jedním z klíčových proteinů zajišťujících přenos kyseliny močové přes membránu epiteliálních buněk proximálního tubulu člověka. Tento protein se u člověka exprimuje přirozeně ve dvou sestřihových variantách: dlouhé (GLUT9L) a krátké (GLUT9S), které se vzájemně liší sekvencí N-konce. Každá z těchto izoforem je lokalizována na jiný pól epiteliální buňky, přičemž se předpokládá, že řídící sekvence pro lokalizaci proteinu je přítomná právě ve vzájemně rozdílné N-koncové doméně. U proteinu byly také zjištěny četné alelické varianty měnící jeho transportní schopnosti. Tato diplomová práce se zabývá ověřením vlivu nově objevené alelické varianty představující záměnu valinu na pozici 114 za leucin (V114L, u krátké izoformy odpovídající alelická varianta V85L) na schopnost přenášet kyselinu močovou. Zároveň se práce snaží ověřit vliv mutací v motivech, které by mohly být zodpovědné za lokalizaci proteinu, na jeho umístění v buňce a rovněž tak na transport kyseliny močové. Testovány byly dva dileucinové motivy 12LGL14 a 33LL34 a tyrosinový motiv 84YIKA87. Funkční studie s 14 C radioaktivně značeným urátem prokázaly signifikantní snížení transportní funkce u alelické varianty V114L/V85L u obou izoforem proteinu ve směru efluxu. Byly také testovány vytipované...