Vliv elučního roztoku na obohacení a přečištění glykopeptidů pomocí SPE-HILIC

Abstract

Changes in protein glycosylation are related to various diseases such as cancer or Alzheimer's disease. Unfortunately, the analysis of glycoproteins remains a difficult task due to the low proportion of glycopeptides compared to peptides obtained after glycoprotein cleavage. As a result, it is almost impossible to analyze glycopeptides without specific enrichment steps. A suitable method for the enrichment of glycopeptides is solid phase extraction (SPE) using the principle of hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC). Since the choice of solvent significantly affects the enrichment of glycopeptides, the aim of this thesis was to compare the effect of different solvents on the efficiency of glycopeptide extraction using SPE-HILIC. The extraction was carried out on a silica column modified with aminopropyl groups. Model analytes were glycopeptides obtained by tryptic digestion of human IgG. During the comparsion of acetonitrile, methanol and isopropanol, acetonitrile was chosen as a suitable elution solvent. During the conditioning and washing step, the content of acetonitrile was changed (65%, 75% and 85%), whereby the elution of glycopeptides is accelerated as the amount of acetonitrile decreases. In the elution step, the effectiveness of different acetonitrile contents (5%, 10% and...

Změny v glykosylaci proteinů souvisejí s různými nemocemi jako je rakovina nebo Alzheimerova choroba. Bohužel, analýza glykoproteinů zůstává obtížným úkolem kvůli nízkému podílu glykopeptidů ve srovnání s peptidy získanými po štěpení glykoproteinu. V důsledku toho je téměř nemožné analyzovat glykopeptidy bez specifických kroků obohacení. Vhodnou metodou na obohacení glykopeptidů je extrakce na pevné fázi (SPE) využívající princip hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC). Jelikož výběr rozpouštědla významně ovlivňuje obohacení glykopeptidů, cílem této diplomové práce bylo porovnat vliv různých rozpouštědel na účinnost extrakce glykopeptidů pomocí SPE-HILIC. Extrakce byla prováděna na kolonce s oxidem křemičitým modifikovaným aminopropylovými skupinami. Modelovými analyty byly glykopeptidy získané tryptickým štěpením lisdkého IgG. Při porovnání acetonitrilu, methanolu a isopropanolu byl jako vhodné eluční rozpouštědlo vybrán acetonitril. Při kondicionačním a promývacím kroku byl měněn obsah acetonitrilu (65%, 75% a 85%), přičemž se snižujícím se množstvím acetonitrilu se zrychluje eluce glykopeptidů. V elučním kroku byla zkoumána účinnost různého obsahu acetonitrilu (5%, 10% a 20%), kdy k nejrychlejší eluci docházelo při nejvyšším obsahu acetonitrilu v elučním roztoku. Zkoumání různého...