Approaches to the enzymatic synthesis of hypermodified DNA polymers

Abstract

Cílem této práce bylo nasyntetizovat novou sérii modifikovaných 2'- deoxynukleosidtrifosfátů (dNTP) nesoucích hydrofobní modifikace, použít je v enzymové syntéze plně modifikované DNA a studovat její bio-fyzikální vlastnosti. V první části práce byla nasyntetizována série čtyř 2'-deoxynukleosidů nesoucích lineární nebo rozvětvenou alkylovou, indolovou nebo fenylovou skupinu pomocí Sonogashirovy cross- couplingové reakce. Ethynylové linkry příslušných nukleosidů byly redukovány katalytickou hydrogenací za účelem získání dalších čtyř nukleosidů nesoucích modifikace prostřednictvím alkylového linkeru. Všech osm nukleosidů bylo poté přeměněno fosforylací na 2'- deoxynukleosidtrifosfáty (dNTP), podle Yoshikawy, a jednotlivě testovány jako substráty pro polymerázovou syntézu prodloužením primeru (PEX). Byla zkoumána jejich kombinace za účelem vytvoření DNA obsahující jednu nebo dokonce čtyři modifikované nukleotidy. Podařilo se nahradit všechny čtyři kanonické nukleotidy hydrofobně modifikovanými protějšky a syntetizovat tak DNA s vysokou hustotou modifikací. Nicméně pro syntézu delší plně modifikované DNA byly vhodné pouze nukleotidy nesoucí modifikace prostřednictvím rigidního ethynylového linkru. Nukleotidy s vice flexibilním alkylovým linkerem destabilizovaly během syntézy duplex DNA, pravděpodobně...

The aim of this thesis was to synthesize new series of modified 2'-deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) bearing hydrophobic modifications, use them in enzymatic synthesis of fully-modified DNA and study its bio-physical properties. In the first part of the thesis, a set of four 2'-deoxynucleosides bearing a linear or branched alkane, indole or phenyl group were synthesized by Sonogashira cross-coupling reactions using alkynes and iodinated nucleosides. Ethynyl linkers of corresponding nucleosides were reduced by catalytic hydrogenation to obtain another four nucleosides bearing the modifications through alkyl linker. All eight nucleosides were then transformed into 2'-deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) by Yoshikawa phosphorylation and individually tested as substrates for polymerase synthesis by primer extension (PEX). Their combinations were systematically tested to generate DNA containing one or even four modified nucleotides. It was possible to replace all four canonical nucleotides with hydrophobically-modified counterparts and thus synthesize DNA with high density of modifications. Nevertheless, only nucleotides bearing modifications through rigid ethynyl linker were suitable for synthesis of longer hypermodified DNA. Nucleotides with more flexible alkyl linker destabilized duplex during...