Assay for testing inhibitors of α-synuclein amyloid fibril formation in cells

Abstract

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease worldwide and has no cure yet. During PD progressive neuronal loss is accompanied by the formation of Lewy Bodies - abnormal intracellular aggregates, which are mostly formed by fibrils of neuronal protein α-synuclein (αSyn). Aggregation of αSyn was shown to correlate with the pathology progression during PD. Therefore, inhibition of αSyn aggregation and subsequent pathology spreading is a promising approach to the disease treatment. In previous years, a high variety of such inhibitors were developed including small molecules, antibodies, and fibril end-targeting proteins. While these inhibitors were profoundly tested in solutions, their performance in cell- based assays remained unclear. The main reason for this was the absence of a reliable high-throughput cell-based assay for αSyn aggregation evaluation. The application of such an assay is particularly important in the case of molecules that target amyloid fibrils because they can lack specificity and interact with other β-sheet rich proteins present in cells. Moreover, the application of the inhibitors can be severely limited due to poor membrane penetration, intracellular degradation or off-target interactions. The main goal of my work is the development of an assay...

Parkinsonova nemoc (PD) je celosvětově druhým nejčastějším neurodegenerativním onemocněním a dosud není vyléčitelná. Během PD je progresivní ztráta neuronů doprovázena tvorbou Lewyho tělísek - abnormálních intracelulárních agregátů, které jsou většinou tvořeny fibrilami proteinu α- synukleinu (αSyn) neuronech. Bylo zjištěno, že agregace αSyn koreluje s progresí PD. Slibným přístupem k léčbě onemocnění by tedy byla inhibice agregace αSyn a jejího následného patologického šíření. V předchozích letech byla vyvinuta široká škála inhibitorů agregace αSyn, včetně malých molekul, protilátek a proteinů cílících na konce fibril αSyn. Zatímco tyto inhibitory byly důkladně testovány v roztocích, jejich účinnost v testech na buňkách zůstala nejasná. Hlavním důvodem byla absence spolehlivého vysoce účinného testu pro hodnocení agregace αSyn v buňkách. Takový test je zvláště důležitý pro testování molekul cílících na amyloidní fibrily uvnitř buněk kvůli nespecifické a nežádoucí interakci s jinými buňčnými proteiny bohatými na β-list. Kromě toho může být aplikace inhibitorů značně omezena kvůli špatné penetraci přes buněčnou membránu a intracelulární degradaci. Hlavním cílem mé práce byl vývoj testu vhodného pro hodnocení účinnosti inhibitorů agregace αSyn v buněčném prostředí. Tento test by měl být schopen...