Novel fluorescent nucleotides for metabolic labelling and for the construction of DNA probes

Abstract

The aim of the thesis was to synthesize new nucleosides, nucleotides and the corresponding DNA probes bearing various fluorescent labels, which can be used for bioanalytical applications. In the first part of the thesis, 2'-deoxycytidine and the corresponding nucleoside triphosphate bearing tryptophan-based imidazolinone fluorophore were synthesized by Sonogashira cross-coupling reaction. The fluorophore showed sensitivity to pH and viscosity. Nucleotide was used for the construction of modified oligonucleotides (ON) and DNA by primer extension (PEX) or polymerase chain reaction (PCR). Labelled ON probe was used for sensing interaction with single-strand binding protein, which resulted in increased fluorescence intensity of modified ON. Next, thymidine and thymidine triphosphate labelled by bezylidene- tetrahydroxanthylium fluorophore were synthesized by copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Fluorescence of the fluorophore is dependent on the polarity and viscosity of the environment. Incorporation of the modified nucleotide into DNA, by PEX or PCR, led to dramatic increase of the fluorescence presumably due to the interactions of the fluorophore in the major groove. Unfortunately, the modified nucleotide was not suitable for in cellulo imaging due to its cytotoxicity. The modified...

Cílem této dizertační práce byla syntéza nových nukleosidů, nukleotidů a příslušných DNA sond nesoucích různé fluorescenční značky pro bioanalytické aplikace. V první části práce byl pomocí Sonogashiry cross-kapling reakce syntetizován 2'-deoxycytidin a jeho trifosfát nesoucí imidazolinový fluorofor na bázi tryptofanu. Daný fluorofor vykazoval citlivost na pH a viskozitu. Nukleotid byl použit pro konstrukci modifikovaných oligonukleotidů (ON) a DNA prodlužováním primeru (PEX) nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Značená ON sonda byla použita pro snímání interakce se single-strand vazebným proteinem, což vedlo ke zvýšení intenzity fluorescence modifikovaného ON. Dále byl připraven thymidin a thymidin-5'-O-trifosfát, nesoucí benzyliden- tetrahydroxanthyliový fluorofor, pomocí mědí katalyzované azid-alkynové cykloadice (CuAAC). Fluorescence fluoroforu je závislá na polaritě a viskozitě prostředí. Inkorporace modifikovaného nukleotidu do DNA pomocí PEX nebo PCR vedlo k dramatickému zvýšení fluorescence, pravděpodobně díky interakcím fluoroforu ve velkém žlábku. Bohužel, modifikovaný nukleotid nebyl vhodný pro vizualizace v buňkách kvůli své cytotoxicitě. Modifikovaná dsDNA byla použita jako fluorescenční sonda pro snímání interakcí s malými molekulami a proteiny změnou fluorescence. Nakonec byl...