Produkce cysteinových katepsinů a strukturní charakterizace jejich interakce s peptidomimetickými inhibitory
Production of cysteine cathepsins and structural characterization of their interaction with peptidomimetic inhibitors
diplomová práce (OBHÁJENO)
Omezená dostupnost dokumentu
Celý dokument nebo jeho části jsou nepřístupné do 13. 09. 2025
Důvod omezené dostupnosti:
ochrana duševního vlastnictví, zejména ochrana vynálezů či technických řešení
Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/176856Identifikátory
SIS: 231414
Kolekce
- Kvalifikační práce [20319]
Autor
Vedoucí práce
Oponent práce
Knejzlík, Zdeněk
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
Biochemie
Katedra / ústav / klinika
Katedra biochemie
Datum obhajoby
13. 9. 2022
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Čeština
Známka
Výborně
Klíčová slova (česky)
cysteinové katepsiny, rekombinantní exprese, peptidomimetické inhibitory, krystalizace proteinu, 3D struktura proteinu, inhibiční mechanismusKlíčová slova (anglicky)
cysteine cathepsins, recombinant expression, peptidomimetic inhibitors, protein crystallization, 3D protein structure, inhibition mechanismCysteinové katepsiny se účastní řady patologických procesů jako jsou nádorová, neurodegene- rativní, kardiovaskulární nebo autoimunitní onemocnění. Tato práce se zaměřuje na katepsin B, L a V (CatB, CatL, CatV), které jsou atraktivními cílovými molekulami pro vývoj inhibitorů jako potenciálních chemoterapeutik a diagnostických nástrojů. Cílem práce bylo připravit uve- dené katepsiny a strukturně charakterizovat jejich komplexy s vybranými syntetickými pepti- domimetickými inhibitory. CatB a CatL byly rekombinantně připraveny v kvasinkách Pichia pastoris a podmínky exprese byly optimalizovány pro přípravu proenzymových forem. Pro CatB a CatL byl navržen chromatografický purifikační protokol a CatV byl purifikován na zá- kladě již známého protokolu. Získané enzymy byly použity k přípravě komplexů se šesti pep- tidomimetickými inhibitory vybavenými karbamátovou, vinylsulfonovou nebo azanitrilovou reaktivní skupinou, které selektivně inhibují CatB, CatL, resp. CatV. Byly určeny jejich inhi- biční parametry v kinetickém testu a identifikovány počáteční krystalizační podmínky. Po op- timalizaci krystalizačních podmínek pro CatB se třemi karbamátovými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu. Na základě krystalových struktur těchto kom- plexů byl analyzován vazebný mód...
Cysteine cathepsins participate in many pathological processes such as cancer and neurodegen- erative, cardiovascular, or autoimmune diseases. This work is focused on cathepsins B, L, and V (CatB, CatL, CatV), which represent attractive targets for the development of inhibitors as potential chemotherapeutics and diagnostic tools. The aim of this study was to prepare these cathepsins and structurally characterize their complexes with selected synthetic peptidomimetic inhibitors. Recombinant CatB and CatL were prepared in the yeast Pichia pastoris, and the expression conditions were optimized for the production of cathepsin zymogens. A chromato- graphic purification protocol was designed for CatB and CatL, while CatV was purified using a previously developed procedure. The obtained enzymes were used to prepare complexes with six peptidomimetic inhibitors equipped with a carbamate, vinyl sulfone, or azanitrile warhead, which selectively target CatB, CatL, and CatV, respectively. Their inhibition parameters were determined in a kinetic assay and initial crystallization conditions were identified. After opti- mizing the crystallization conditions for CatB with three carbamate inhibitors, crystals suitable for X-ray crystallography were obtained. Based on the crystal structures of these complexes, the...