Strukturní a funkční studie MICAL signalizace v dynamice cytoskeletu

Abstract

The main focus of this project was chicken protein MICAL1, which is involved in the semaphorin-plexin signalling pathway and has a significant effect on the rearrangement of the cytoskeleton. The prominent role of the MICAL1 protein is primarily associated with axon guidance, as it destabilizes actin filaments through its oxidative activity. We focused on elucidating the molecular mechanisms of chicken MICAL1 autoinhibition using molecular and structural biology methods together with new protein structure prediction methods. Chicken MICAL1 was produced in Sf9 insect cells using a baculovirus expression system and we produced both full-length and truncated versions of chicken MICAL1 protein. We kinetically characterized the protein and determined its oligomeric state in solution. We made great efforts to solve the protein structure using crystallography, electron microscopy and protein structure prediction in Alphafold 2. Based on the results of these experiments and assays, we conclude that MICAL1 proteins are regulated through their C terminal domain, which interacts with the monooxygenase domain. The part of this interaction is the autoinhibition of chicken MICAL1. We excluded the possibility that chicken MICAL1 is regulated by changing its oligomeric state. The results of this master's thesis...

Předmětem této práce byl kuřecí protein MICAL1, který se zapojuje do semaforin- plexin signální dráhy a má významný vliv na přeskupování cytoskeletu. Význačná role MICAL1 proteinu je spojována především s naváděním axonů, jelikož destabilizuje aktinová filamenta prostřednictvím své oxidační aktivity. Zaměřili jsme se na objasnění molekulárních mechanismů autoinhibice kuřecího MICAL1 za pomoci metod molekulární a strukturní biologie společně s novými metodami predikce proteinových struktur. Kuřecí MICAL1 byl vyroben v hmyzích buňkách Sf9 bakulovirovým expresním systémem, přičemž byla vyprodukována jak plná, tak zkrácená verze kuřecího proteinu MICAL1. Proteiny jsme charakterizovali kineticky a určili oligomerní stav kuřecího MICAL1 v roztoku. Velké úsilí jsme věnovali rozřešení proteinové struktury pomocí krystalografie, elektronové mikroskopie a predikce v programu Alphafold 2. Na základě výsledků těchto metod jsme vyvodili, že MICAL1 proteiny jsou regulovány skrze svou C terminální doménu, která interaguje s monooxygenázovou doménou. V rámci této interakce tak dojde k autoinhibici kuřecího MICAL1. Vyloučili jsme možnost, že by kuřecí MICAL1 byl regulován změnou svého oligomerního stavu. Výsledky této diplomové práce budou sloužit pro další studium interakce MICAL1 v rámci navazujících diplomových...