Optimalizace digitální polymerázové řetězové reakce pro aplikaci v neinvazivní prenatální diagnostice

Abstract

Digital PCR (Polymerase Chain Reaction) is a method that enables absolute quantification of DNA sequences and therefore finds application in many diagnostic disciplines. We focused on the diagnosis of trisomy 21, which manifests itself as Down syndrome. Information about the fetal genome can be obtained from free fetal DNA that is released into the mother's bloodstream from the placenta during pregnancy. In the first trimester, fetal DNA constitutes approximately 5-10% of free DNA and is therefore a suitable target for non-invasive prenatal testing (NIPT). However, we need a technique that is able to distinguish this relatively small fraction of free fetal DNA and differentiate it from free maternal DNA. Precisely digital PCR provides various ways to achieve this goal thanks to its wide multiplexing possibilities. We focused on optimizing the multiplex reaction, which in one fluorescence channel distinguishes the number of copies of the reference chromosome 18 and the observed chromosome 21. The resulting determination of this ratio provides us with information regarding the balance between the chromosomes and can thus confirm or refute the presence of a trisomic fetal fraction. We tested the usability of the proposed method for clinical application by examining DNA samples isolated from 25 plasma...

Digitální PCR (Polymerase Chain Reaction) je metoda umožňující absolutní kvantifikaci sekvencí DNA a proto nachází uplatnění v mnoha diagnostických disciplínách. Zaměřili jsme se na diagnostiku trisomie 21. chromosomu, která se projevuje jako Downův syndrom. Informace o genomu plodu lze získat z volné fetální DNA, která se během těhotenství uvolňuje do krevního řečiště matky z placenty. V prvním trimestru fetální DNA tvoří přibližně 5-10 % volné DNA a je tudíž vhodným cílem pro neinvazivní prenatální testování (NIPT). Potřebujeme však techniku, která je schopna rozlišit tuto relativně malou frakci volné fetální DNA a odlišit ji od volné DNA matky. Právě digitální PCR poskytuje díky širokým možnostem multiplexování různé způsoby, jak tohoto cíle dosáhnout. Zaměřili jsme se na optimalizaci multiplex reakce, která v jednom fluorescenčním kanále rozlišuje počet kopií referenčního chromosomu 18 a sledovaného chromosomu 21. Výsledné stanovení tohoto poměru nám poskytuje informaci ohledně rovnováhy mezi chromosomy a může nám tak potvrdit či vyvrátit přítomnost trisomické fetální frakce. Využitelnost navržené metody pro klinickou aplikaci jsme testovali vyšetřením vzorků DNA izolovaných z 25 vzorků plazmy těhotných se zdravými plody a z 15 vzorků plazem od těhotných s plody postiženými Downovým syndromem....