Optimalizace metody izotermální amplifikace zprostředkované smyčkou pro testování infekce způsobené bakterií Streptococcus pneumoniae

Abstract

Streptococcus pneumoniae is grampositive pathogen bacteria. According to World Health Organisation, diseases like pnemoniae or meningitidis are most commonly caused by S. pneumoniae infection. Gold standard for pathogen detection is currently polymerase chain reaction based on specific DNA amplification. During the last decades, many DNA amplification methods have been developed. One of them is loop mediated isothermal amplification (LAMP). Thanks to low instrumental requirements and simple interpretation, this method should be appropriate alternative for pathogen detection. Putting LAMP into clinical practise is complicated mainly because of common false positive results occurance in non DNA containing samples. Based on that, one of the aims of the thesis was to identificate and eliminate main sources of DNA contamination. According to the results, the main source of contamination seems to be the products from previous reactions. Nowdays, lytA and piaB genes are the most commonly used as targets for PCR detecion of S. pneumoniae. In available publications, there is not any mention about targetting LAMP method at piaB gene for detection of S. pneumoniae. That is why the aim of this bachelor thesis was to design optimal LAMP "primers" set for piaB gene detection. Within the optimization of the...

Streptococcus pneumoniae je grampozitivní patogenní bakterie. Podle světové zdravotnické organizace je tato bakterie nejčastěji se vyskytujícím mikrobiálním zdrojem onemocnění jako je pneumonie či meningitida u dětí. Standardem pro detekci patogenů je v současnosti polymerázová řetězová reakce. V posledních desetiletích došlo k rozvoji amplifikačních metod, mezi které se řadí také izotermální amplifikace zprostředkovaná smyčkou, která by díky své nízké instrumentální náročnosti i jednoduchému způsobu vyhodnocení mohla představovat vhodnou alternativu pro detekci patogenů. Zavedení této metody do klinické praxe je komplikováno častým výskytem falešné pozitivity u vzorků neobsahujících příslušnou DNA. V rámci předkládané bakalářské práce bylo proto velmi důležité identifikovat a odstranit hlavní zdroj kontaminace, jimž se na základě dosažených výsledků zdají být produkty předchozích reakcí. V současnosti se pro detekci bakterie S. pneumoniae metodou PCR nejčastěji využívají geny lytA a piaB. V dostupných zdrojích není zmínka o využití genu piaB pro LAMP detekci bakterie S. pneumoniae. Předmětem této práce bylo navržení optimální sady LAMP "primerů" pro detekci tohoto genu. V rámci optimalizace metody byly LAMP experimenty prováděny s využitím různých způsobů vizualizace produktů reakce, konkrétně...