Produkce toxinů bakterií Bacillus subtilis a jejich role v konkurenčním boji s dalšími bakteriemi

Abstract

Bacillus subtilis je gram pozitivní půdní bakterie, která je v prostředí obklopena mnoha jinými mikroorganismy. Z tohoto důvodu je potřebné, aby byla bakterie schopná soutěžit s těmito mikroorganismy o živiny a životní prostor. B. subtilis má ve své genetické výbavě moduly, které ji pomáhají v konkurenceschopnosti. Tyto moduly jsou označeny jako toxin- antitoxin systémy. Tato diplomová práce je zaměřena na identifikaci dosud nepopsaných extracelulárních toxinů, produkovaných divokým kmenem B. subtilis BSB1. Jako konkurenční bakterie byl použit příbuzný mikroorganismus Bacillus megaterium. Na tomto systému byl demonstrován kontakt závislý a nezávislý způsob usmrcení konkurenční bakterie. Pomocí delečních analýz a porovnání genomů divokých kmenů B. subtilis byl zprvu identifikován profág SPβ jako oblast, která obsahuje neznámý toxin(y). Analýzou extracelulárního proteomu B. subtilis bylo následně odhaleno, že toxin (případně toxinový komplex) dosahuje molekulové hmotnosti přesahující 100 kDa. O to více bylo fascinující zjištění, že je takto veliká proteinová molekula odolná vůči působení pankreatické proteázy, trypsinu. Následné neenzymatické bromkyanové štěpení extracelulárních proteinů a jejich analýza hmotnostní spektrometrií odhalily potenciální toxinové kandidáty, které se nacházejí na profágu...

Bacillus subtilis is a gram positive soil bacterium that is surrounded by many other microorganisms its environment. That is why it is necessary for the bacterium to be able to fight with these microorganisms for the nutrients and living space. B. subtilis contains the modules in its genetic make-up that improve its ability to compete. These modules are called the toxin-antitoxin systems. This Diploma Thesis is trying to identify yet undescribed extracellular toxins produced by the wild type BSB1 strain of B. subtilis. The related microorganism Bacillus megaterium was used as a competing bacterium. The contact-dependent or independent manner of killing the competing bacterium was demonstrated using this model. By deletion analysis and comparisons of the genomes of the various strains of B. subtilis, the SPβ prophage was first identified as a region containing an unknown toxin(s). Analysis of the extracellular proteome of B. subtilis subsequently revealed an unknown toxin (or toxin complex, respectively) of the molecular weight exceeding 100 kDa. Even more fascinating was the finding that such a large protein molecule is resistant to the pancreatic protease, trypsin. Subsequent non-enzymatic cyanogen bromide cleavage of the extracellular proteins and their analysis by mass spectrometry revealed...