Funkčná charakterizácia MDR pumpy Pdr5p zodpovednej za mnohopočetnú liekovú rezistenciu u kvasinky Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Jedním z hlavních důvodů selhávání léčby infekcí způsobených patogenními mikroor- ganismy je nadměrná exprese membránových proteinů, které aktivně odstraňují léky z buněk, což vede k fenoménu zvanému mnohočetná léková rezistence MDR. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci MDR pumpy Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Ověřili jsme, že je možné použít dis-C3(3) fluorescenční metodu pro stanovení vazebných míst, do kterých se substráty vážou ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p. Zaměřili jsme se na studium vazebné kapsy ScPdr5p pomocí triazolových derivátů: ravukonazolu, vorikonazolu a flukonazolu. Pomocí zónového testu jsme ukázali, že všechny tři studo- vané triazoly jsou substráty pumpy ScPdr5p. Zjistili jsme, že tyto strukturní analogy mají výrazně odlišný vliv na inhibici transportu potenciometrické fluorescenční sondy dis-C3(3) pumpou ScPdr5p, a také, že ravukonazol s vorikonazolem vzájemně kompetují o transport pumpou ScPdr5p. Využili jsme fluorescenční přístup ke studiu vazby azolů do vazebné kapsy pumpy ScPdr5p pomocí benchmark substrátů, které se vážou selek- tivně pouze do jednoho vazebného místa ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p, a podpořili jsme tak hypotézu, že ravukonazol a vorikonazol se vážou do více než jednoho vazebného místa. 1

One of the main reasons for the treatment failure of infections caused by pathogenic microorganisms is the overexpressing of efflux membrane proteins, which actively remove drugs from cells, leading to a phenomenon called multidrug resistance MDR. In this work, we focused on the functional characterization of the MDR pump Pdr5p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We have verified that diS-C3(3) fluorescence method can be used to determine the binding sites where the substrates bind in the binding pocket of the pump ScPdr5p. We focused on the study of the ScPdr5p binding pocket using triazole derivatives: ravuconazole, voriconazole and fluconazole. Using disc diffusion assay, we showed that all three studied triazoles are substrates of the pump ScPdr5p. We have found that these structural analogs have a significantly different effect on the inhibition of the potentiometric fluorescent probe diS-C3(3) transport by the pump ScPdr5p, and also that ravuconazole and voriconazole compete with each other for transport by the pump ScPdr5p. We have used a fluorescent approach to study the binding of azoles to the binding pocket of pump ScPdr5p using benchmark substrates, that bind selectively to only one binding site in the binding pocket of the pump ScPdr5p, and we have supported the hypothesis that ravuconazole...