CFTR-mRNA: alternativa pro genovou terapii cystické fibrózy

Abstract

Cystická fibróza je onemocnění, u kterého dochází k mutaci CFTR genu kódujícího stejnojmenný protein, jehož hlavní funkcí je přenos chloridových iontů. K napravení tohoto defektu byla v rámci diplomové práce vybrána genová terapie. Byly syntetizovány dva typy stabilní mRNA obsahující minimálně 200 adeninů na 3' konci, 25 % pseudouridinu, 25 % 5-methylcytidinu a na 5' konci buďto klasickou čepičku (enzymová mRNA) nebo analog čepičky 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (tzv. ARCA mRNA). Byly použity buněčné linie od zdravých jedinců (NuLi-1) a pacientů trpících cystickou fibrózou s mutací F508del (CuFi-1). Vizualizace CFTR proteinu pomocí optimalizované metody nepřímé imunofluorescence potvrdila zvýšení exprese CFTR proteinu u obou buněčných linií CuFi-1 a NuLi-1, a to jak při použití ARCA mRNA tak při použití enzymové mRNA. Funkčnost CFTR proteinu byla stanovena prostřednictvím fluorescenčního barviva N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxychinolinu (MQAE), kterým byly buněčné linie předem obarveny a které je specificky zhášeno halogenovými ionty. Transport iontů skrze tento kanál byl ověřen použitím CFTR(inh)-172, který specificky tento kanál inhibuje svou vazbou na R doménu. Po 24h transfekci ARCA mRNA buněčné linie CuFi-1 došlo k obnově jeho funkce. V neposlední řadě byla studována adheze bakterií Pseudomonas...

Cystic fibrosis is a genetic disease caused by mutation of the CFTR gene coding homonymous protein, whose main function is transport of chloride ions. In this thesis, gene therapy was used for correction of this defect. Two types of stable mRNA was synthetised - both contained at least 200 adenines on the 3' end, 25 % of pseudouridine, 25 % of 5-methylcytidine and classical cap (enzyme mRNA) or cap analogue 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA cap) on the 5' end. Cell lines isolated from healthy volunteer (NuLi-1) and those from patient suffering from cystic fibrosis with F508del mutation (CuFi-1) were used. The mRNA transfection efficiency was determined using different methods. Increased expression of the CFTR protein was confirmed by visualization of this protein by optimized immunofluorescence method in both cell lines while using both ARCA mRNA and enzyme mRNA. CFTR protein function was studied using fluorescent probe N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinoline (MQAE), which is quenched by halogen ions. CFTR channel ion transport was verified using CFTR(inh)-172. This inhibitor specifically inhibits this channel through binding on the R domain of the CFTR protein. CFTR protein function was restored after 24h transfection of the CuFi-1 cell line by ARCA mRNA. The bacterial adhesion of Pseudomonas...