Studium post translačních modifikací fosducinu

Abstract

Předkládaná diplomová práce se zabývá studiem úlohy posttranslačních modifikací fosducinu na jeho interakci s proteinem 14-3-3 a dále posouzení vlivu tvorby komplexu na tyto modifikace. Fosducin je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také v jiných tkáních. Přes mnohé experimenty jsou však jeho fyziologické funkce stále řešeným tématem. Spekuluje se o jeho vlivu při regulaci signální dráhy oční sítnice, krevního tlaku a exprese G-proteinů. Funkce fosducinu je regulována proteinem 14-3-3, jenž hraje roli v mnohých biochemických procesech. Tvorba komplexu mezi proteinem 14-3-3 a fosducinem vyžaduje fosforylaci dvou serinových zbytků v N-terminální doméně molekuly fosducinu. Úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je ovšem stále nejasná. V rámci této diplomové práce byly exprimovány proteiny 14-3-3ζ∆C a fosducin (s mutací Q52K) a úspěšně purifikovány. Ke studiu vlivu tvorby komplexu na posttranslační modifikace fosducinu bylo využito limitované proteolýzy a defosforylace. Experimenty ukázaly, že tvorba komplexu způsobuje významné zpomalení defosforylace Ser-54 i Ser-73 a proteolytické degradace, což indikuje protektivní funkci vazby proteinu 14-3-3ζ∆C. Úloha obou 14-3-3ζ∆C vazebných motivů obsahujících Ser-54 a Ser-73 pro interakci fosducinu s...

The aim of this diploma thesis was to study the role of posttranslational modifications of phosducin and their role in the interaction with the 14-3-3 protein as well as the influence of the complex formation on these modifications. Phosducin is a 33kDa protein commonly present in photoreceptor cells of the retina as well as other tissues. Despite many experiments, its physiological functions are still elusive. It has been speculated that fosducin plays an important regulatory role in visual phototransduction pathway, regulation of blood pressure and expression of G-proteins. The phosducin function is regulated through binding to the 14-3-3 protein, a regulatory protein involved in many biochemical processes. Phosducins binding to 14-3-3 protein requires phosphorylation of two serine residues Ser-54 and Ser-73 within the N-terminal domain of phosducin. However, the role of the 14-3-3 protein binding in the regulation of phosducin function is still unclear. In this diploma thesis proteins 14-3-3ζ∆C and phosducin (mutation Q52K) were successfully expressed and purified. The effect of the complex formation on phosducin posttranslational modifications was investigated using limited proteolysis and dephosphorylation. These experiments revealed that the complex formation significantly slowed down both...